C5aR穩(wěn)定表達(dá)株的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)自然界中最大的蛋白質(zhì)家族成員之一，存在于從低等動(dòng)物酵母至人類(lèi)器官，據(jù)統(tǒng)計(jì)大約1％的人類(lèi)基因組編碼GPCRs而30％的藥物是以GPCRs為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的。GPCR由一條400-600個(gè)氨基酸組成的多肽鏈構(gòu)成，這條多肽鏈有7個(gè)分肽段穿越細(xì)胞膜形成7個(gè)跨膜區(qū)(transmembrane domain，TMD)。補(bǔ)體裂解片段C5a受體(The complement C5

2、anaphylatoxin receptor，C5aR；CD88)GPCR家族成員之一，是7次跨膜a螺旋受體，其N(xiāo)端在細(xì)胞外側(cè)，含有N-糖基化位點(diǎn)； C端在細(xì)胞內(nèi)，其上有磷酸化位點(diǎn)。中段七個(gè)分肽段穿越細(xì)胞膜形成7個(gè)跨膜區(qū)，它們藉6個(gè)細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)由親水性氨基酸構(gòu)成的突環(huán)連接起來(lái)。細(xì)胞外3個(gè)分別稱為e1、e2及e3；細(xì)胞內(nèi)3個(gè)分別稱為i1、i2及i3。e1和e2之間由兩個(gè)保守的Cys形成一個(gè)二硫鍵。不同GPCR的TMD為分子的保守區(qū)，具

3、有極大的相似性，而兩端區(qū)域及突環(huán)的氨基酸則變異程度較大。 C5aR主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞上。野生型的C5aR的表達(dá)細(xì)胞分離困難，對(duì)C5aR的功能及信號(hào)事件的研究較難進(jìn)行。體外建立一個(gè)有生物學(xué)活性，穩(wěn)定表達(dá)C5aR的細(xì)胞株對(duì)我們進(jìn)一步研究C5aR的生物學(xué)功能有很大的意義。 目的： 構(gòu)建重組人C5aR的真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染入含有Ga16基因的Molt-4細(xì)胞中，獲得一株穩(wěn)定表達(dá)C5aR的細(xì)胞株

4、。為以后繼續(xù)探討C5aR的生物學(xué)功能以及C5aR單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。 方法： 通過(guò)RT-PCR從人中性粒細(xì)胞中釣取C5aR全長(zhǎng)基因，重組到pGEM-T Easxvector中進(jìn)行基因克隆，經(jīng)核酸序列測(cè)定正確后，將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA4.0中，轉(zhuǎn)染至Molt-4細(xì)胞系并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定篩選。通過(guò)Zeocin加壓及亞克隆篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)C5aR的細(xì)胞株。Westen blot檢測(cè)了人標(biāo)準(zhǔn)C5a對(duì)Molt-4/C5

5、aR細(xì)胞的激活作用，細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)檢測(cè)了Molt-4/C5aR細(xì)胞經(jīng)C5a刺激后第二信使鈣離子的調(diào)動(dòng)情況，小鼠肺灌洗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Molt-4/C5aR細(xì)胞的趨化情況。 結(jié)果： 構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA4.0/C5aR的構(gòu)建并將其轉(zhuǎn)染至Molt-4細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)C5aR的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，正常人新鮮血液中中性粒細(xì)胞上的C5aR表達(dá)率為98.25％，而此穩(wěn)定株C5aR的表達(dá)率為97.35％，幾乎等同與正常人新鮮血

6、液中中性粒細(xì)胞上C5aR的表達(dá)量。PCR技術(shù)及Westen blot鑒定了轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株中仍有Ga16的存在。Westen blot顯示了人標(biāo)準(zhǔn)C5a對(duì)Molt-4/C5aR細(xì)胞的激活作用，引起ERK1/2及PKB/AKT的磷酸化。細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)結(jié)果顯示了Molt-4/C5aR細(xì)胞經(jīng)C5a刺激后第二信使鈣離子的調(diào)動(dòng)，小鼠肺灌洗實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Molt-4/C5aR細(xì)胞對(duì)C5a很好的趨化情況。 結(jié)論： 構(gòu)建了重組形式的C5aR真核

7、表達(dá)載體pcDNA4.0/C5aR,并成功轉(zhuǎn)染至Molt-4細(xì)胞中。通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)MOLT-4/C5aR細(xì)胞株中Ga16沒(méi)有丟失并能夠正常表達(dá)Ga16蛋白，可以進(jìn)行細(xì)胞的信號(hào)及功能研究。Westenblot試驗(yàn)結(jié)果顯示MOLT-4/C5aR細(xì)胞株經(jīng)C5a刺激后能夠引起ERK1/2及PKB/AKT的磷酸化，這更有利于我們對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行更進(jìn)一步的研究并探索新的未知因子。C5a刺激MOLT-4/C5aR細(xì)胞株后可以引起鈣離子的顯著變