豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF4表達(dá)缺失株的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、目的:豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)作為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的主要病原，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，PCV2可能存在人畜共患病原的潛在威脅，但PCV2的致病機(jī)制目前仍不十分清楚。在PCV2分子致病機(jī)理研究中，已有3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)的功能得到驗(yàn)證:ORF1表達(dá)Rep和Rep'兩個(gè)復(fù)制相關(guān)蛋白，參與病毒復(fù)制;ORF2表達(dá)病毒蛋白外殼;ORF3編碼蛋白參與病毒介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。ORF4重疊于ORF3內(nèi)，其對(duì)于病毒致病機(jī)制

2、的功能尚不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建PCV2 ORF4表達(dá)缺失突變病毒，研究該蛋白于病毒復(fù)制和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。同時(shí)，在本課題組前期工作確定ORF3/ORF4發(fā)生轉(zhuǎn)錄并獲得相關(guān)3' poly(A)加尾位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)ORF3/ORF4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5'端起始位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)，為ORF4基因功能研究奠定基礎(chǔ)，為研究PCV2致病機(jī)理提供新的研究方法和理論依據(jù)。
　　方法:首先，在課題組已獲得PCV2基因組全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)上，對(duì)序列進(jìn)行分析，選擇病毒

3、突變位點(diǎn)。通過(guò)起始密碼子突變和引入無(wú)義突變使突變后的閱讀框轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在蛋白翻譯過(guò)程中提前終止，從而無(wú)法產(chǎn)生有效蛋白。依據(jù)PCR定點(diǎn)突變?cè)噭┖性順?gòu)建突變體質(zhì)粒，經(jīng)酶切回收病毒基因組片段，在自環(huán)化反應(yīng)后轉(zhuǎn)染PK-15宿主細(xì)胞以產(chǎn)生突變病毒。產(chǎn)生的病毒通過(guò)檢測(cè)體外復(fù)制能力、RNA剪接和外殼蛋白的形成，最終確定重組及突變病毒的完整性和感染力。構(gòu)建了熒光定量檢測(cè)體系，并利用該體系檢測(cè)等拷貝數(shù)野生型、重組野生型和突變型病毒感染細(xì)胞后病毒DNA拷貝數(shù)

4、和ORF1、ORF3、ORF4 mRNA表達(dá)量差異，分析ORF4蛋白缺失對(duì)病毒復(fù)制的影響。在病毒感染細(xì)胞凋亡分析中，通過(guò)caspase家族活性檢測(cè)，檢測(cè)重組野生型和突變型病毒在病毒介導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能上的差異。最后，利用5' RACE技術(shù)對(duì)ORF4基因mRNA5'末端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了具有體外感染能力的重組野生型和突變型病毒，并且突變病毒的突變位點(diǎn)在連續(xù)傳代第十五代病毒中仍然存在。(2)成功構(gòu)建了可用于

5、病毒滴度及多個(gè)ORF mRNA表達(dá)量測(cè)定的熒光定量檢測(cè)體系，定量范圍為2.53×102～2.53×107拷貝數(shù)之間(R2＞0.99)。(3)通過(guò)檢測(cè)等滴度野生型、重組野生型和突變型病毒感染細(xì)胞后病毒拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)量上的變化，發(fā)現(xiàn)ORF4與病毒復(fù)制能力無(wú)關(guān)。同時(shí)各mRNA表達(dá)量檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，ORF4蛋白缺失不影響ORF4 mRNA表達(dá)。ORF4蛋白的缺失提高了ORF3的mRNA表達(dá)水平而參與病毒介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。同時(shí)，該蛋白缺失使病毒在