豬圓環(huán)病毒2型ORF6基因功能的初步研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染豬可以引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合征及豬壞死性和增生性肺炎等多種疾病。PCV2廣泛流行于全世界范圍內(nèi)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，然而其致病機(jī)制尚不清楚。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，PCV2含有11個(gè)ORFs（ORF1-11）。目前，PCV2被驗(yàn)證鑒定的蛋白有五個(gè)，包括ORF1-5。本研究鑒定了一個(gè)新的蛋白，ORF6。ORF6基因全長(zhǎng)90bp，位于PCV2的負(fù)鏈DNA1611-1522bp，

2、編碼30aa，預(yù)測(cè)分子量為2.8kD。
　　本研究主要鑒定了PCV2ORF6蛋白，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究，具體的研究?jī)?nèi)容有:
　　1.PCV2 ORF6原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　通過設(shè)計(jì)引物連入一個(gè)柔性多肽(Gly4Ser)2，利用PCR，將2個(gè)ORF6基因片段串聯(lián)在一起，再插入pGEX-KG原核表達(dá)載體中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2ORF6。對(duì)其進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，獲得融合表達(dá)蛋白GST-2ORF6，

3、且該蛋白是以可溶形式存在的。進(jìn)一步純化蛋白，免疫2只兔子，獲得兔高免血清。高免血清濃度分別為1.59mg/mL和2.38mg/mL，效價(jià)分別為1∶25×1000和1∶27×1000，抗體1∶1000稀釋可檢測(cè)到500pg抗原。
　　2.PCV2ORF6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)驗(yàn)證
　　ORF6基因完全包含于ORF2中，為驗(yàn)證ORF6 mRNA的轉(zhuǎn)錄，本研究利用熒光定量PCR檢測(cè)了PCV2感染PK-15細(xì)胞后的ORF2+6與ORF2的mRN

4、A差異。結(jié)果病毒感染細(xì)胞后不同時(shí)間ORF2+6 mRNA均明顯多于ORF2 mRNA，不同時(shí)間ORF2+6約是ORF2的2.1～3倍。驗(yàn)證了PCV2ORF6 mRNA的轉(zhuǎn)錄。
　　進(jìn)一步將PCV2野毒接種PK-15細(xì)胞，利用制備的ORF6多抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果觀察到PCV2感染細(xì)胞后有特異性綠色熒光，表明PCV2感染細(xì)胞內(nèi)存在ORF6蛋白。驗(yàn)證了ORF6蛋白的表達(dá)。
　　通過ORF6基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)檢測(cè)，證實(shí)了P

5、CV2ORF6編碼蛋白。
　　3.PCV2ORF6的細(xì)胞定位及真核表達(dá)
　　為研究ORF6蛋白的亞細(xì)胞定位，我們將PCV2野毒接種PK-15細(xì)胞，利用ORF6多抗進(jìn)行IFA檢測(cè)PCV2ORF6在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF6主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)。
　　本研究構(gòu)建了ORF6基因的串聯(lián)雙拷貝的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-2ORF6。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T，通過Western blot檢測(cè)驗(yàn)證了ORF6在體外獲得表達(dá)

6、。
　　4.感染性克隆的構(gòu)建及體外病毒拯救
　　以PCV2全基因組為模板設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增含有特定酶切位點(diǎn)HindⅢ、SacⅡ的 PCV2全長(zhǎng)基因片段和含2個(gè)SacⅡ酶切位點(diǎn)的PCV2全長(zhǎng)基因片段，連入pBluescriptSK載體，構(gòu)建了PCV2雙拷貝感染性克?。ㄒ吧蚉SK-2PCV2）。同時(shí)，為了構(gòu)建ORF6表達(dá)缺失的突變株，通過PCR，將ORF6的起始密碼子ATG進(jìn)行突變?yōu)锳CG，使其表達(dá)沉默，同時(shí)不影響ORF2的蛋白編

7、碼序列。再利用與構(gòu)建野生型PSK-2PCV2同樣方法構(gòu)建ORF6表達(dá)缺失雙拷貝感染性克?。ㄍ蛔冃蚉SK-2PCV2）。
　　將野生型PSK-2PCV2和突變型PSK-2PCV2感染性克隆轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后，盲傳3代。通過熒光定量PCR檢測(cè)、ORF2 mRNA轉(zhuǎn)錄檢測(cè)及IFA試驗(yàn)證實(shí)病毒拯救成功，能在體外增殖傳代。
　　利用熒光定量PCR對(duì)不同病毒的體外增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF6缺失后病毒仍能進(jìn)行復(fù)制，迸一步利用一步

8、法增殖曲線發(fā)現(xiàn)ORF6缺失后病毒的增殖滴度明顯下降。證實(shí)ORF6不是病毒復(fù)制所必需的基因，但ORF6影響病毒在體外的增殖滴度。
　　5.PCV2 ORF6的生物學(xué)功能
　　本研究利用凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)單獨(dú)表達(dá)ORF6及野生型和突變型病毒感染細(xì)胞后的caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，單獨(dú)表達(dá)PCV2ORF6不能激活caspase-3、caspase-8、caspase-9。但突變

9、毒株較野生毒株的caspase-3蛋白活性顯著升高，caspase-8蛋白活性有所下降，caspase-9的蛋白活性無顯著差異。ORF6在PCV2誘導(dǎo)凋亡中的作用還需進(jìn)一步研究。
　　將ORF6真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，利用熒光定量PCR檢測(cè)IFN-β、TNF-α、RANTES、 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-13等細(xì)胞因子的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)表達(dá)ORF6能促使IFN-β、T

10、NF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13細(xì)胞因子表達(dá)量顯著升高。同時(shí)將野生重組型(w-2PCV2)、突變型(m-2PCV2)病毒分別接種PK-15細(xì)胞，熒光定量PCR檢測(cè)上述細(xì)胞因子表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)ORF6缺失導(dǎo)致病毒感染細(xì)胞后IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-13等細(xì)胞因子表達(dá)量顯著下降。綜合ORF6表達(dá)與病毒感染分析，證實(shí)ORF6蛋白能激活I(lǐng)FN-β、 TN

11、F-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　6.PCV2 ORF6對(duì)IL-10的影響
　　IL-10參與病毒感染宿主誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)及免疫抑制反應(yīng)，為探究ORF6引起IL-10表達(dá)量上升的信號(hào)通路，利用不同的信號(hào)通路抑制劑對(duì)其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)蛋白激酶PKC抑制劑GF-109203X能顯著下調(diào)ORF6激活I(lǐng)L-10的表達(dá)量。進(jìn)一步利用不同濃度的GF-109203X抑制劑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ORF6誘

12、導(dǎo)IL-10的表達(dá)量與抑制劑濃度呈反比關(guān)系，即抑制劑濃度越高，其ORF6誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)量越低。表明ORF6誘導(dǎo)IL-10表達(dá)是通過蛋白激酶C通路激活的。
　　總之，本研究新鑒定了PCV2ORF6蛋白，其表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi)。ORF6不是病毒復(fù)制所必需的基因，但ORF6影響病毒在體外的增殖滴度。ORF6蛋白能激活I(lǐng)FN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13細(xì)胞因子的表達(dá)，且通過蛋白激酶C通路激活I(lǐng)