C5aR1在發(fā)育小鼠腦內(nèi)的表達(dá)及促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells)是具有自我更新和分化能力的多潛能干細(xì)胞，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。海馬和室管膜下區(qū)是成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)NSCs最為集中的部位，NSCs增殖和分化的機(jī)制認(rèn)識可為促進(jìn)神經(jīng)損傷再生提供新的途徑。目前以NSCs體外擴(kuò)增和特化為基礎(chǔ)的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療在臨床上得到了初步應(yīng)用，但如何精確調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，還需要進(jìn)一步的研究。
　　 補(bǔ)體(Complement，C)是天然免疫的重要組成部分

2、，C5a是補(bǔ)體C5活化的主要產(chǎn)物之一，通過其受體(C5aR1/2)途徑參與調(diào)節(jié)免疫炎癥、趨化和細(xì)胞溶解等多種生物學(xué)過程；傳統(tǒng)認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫豁免區(qū)，補(bǔ)體在其中作用甚微，但越來越多的的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種細(xì)胞能合成大多數(shù)補(bǔ)體及其受體蛋白，特別在血腦屏障破壞、中樞神經(jīng)炎癥條件下，補(bǔ)體及其受體的表達(dá)上調(diào)，提示補(bǔ)體可能在神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的功能。但補(bǔ)體在正常的神經(jīng)系統(tǒng)以及正常發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)是否具有功能目前還不清楚。而C5a及其受體在神

3、經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)也有證明，既往的研究顯示在造血干細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有補(bǔ)體受體包括C5aR1的表達(dá)，但C5a及其受體在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化過程中的作用目前還沒有報(bào)道。
　　 為了研究C5aR1在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化中的作用，本實(shí)驗(yàn)首先檢測C5aR1在發(fā)育過程中小鼠腦內(nèi)以及體外培養(yǎng)的NSCs內(nèi)的表達(dá)，進(jìn)而用補(bǔ)體受體特異性拮抗肽干預(yù)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，利用活細(xì)胞技術(shù)對比觀察野生型和C5aR1基因敲除小鼠來源的NSC

4、s體外培養(yǎng)特性，證明C5aR1參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用，為深入探討補(bǔ)體系統(tǒng)參與調(diào)控NSCs增殖的作用和機(jī)制提供新的依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)分為以下三個部分：
　　 第一部分：C5aR1在小鼠腦內(nèi)的發(fā)育學(xué)表達(dá)
　　 通過Western blot和免疫組化等技術(shù)檢測發(fā)育不同階段的小鼠腦內(nèi)C5aR1的表達(dá)變化，主要結(jié)果如下：
　　 1、在發(fā)育不同階段，C5aR1有不同的表達(dá)模式。我們檢測了胚胎14天、新生1天、

5、3天、7天以及成年小鼠腦內(nèi)C5aR1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)C5aR1在新生3天和7天時期的腦內(nèi)有較高的表達(dá)水平，成年腦內(nèi)C5aR1表達(dá)水平較低。
　　 2、比較新生期小鼠腦內(nèi)不同腦區(qū)C5aR1的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)，C5aR1主要在海馬、室周以及室管膜區(qū)域表達(dá)，在皮層有較低水平表達(dá)。C5aR1在不同腦區(qū)的這種表達(dá)模式與神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin的表達(dá)模式基本相似。
　　 以上結(jié)果表明：在正常腦發(fā)育過程中均有C5aR1的表達(dá)，在新生小鼠

6、腦內(nèi)的表達(dá)定位與神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志nestin類似，可以推測C5aR1可能參與調(diào)節(jié)腦發(fā)育過程了NSCs的增殖或者分化過程。為了證實(shí)這個推測，我們進(jìn)行第二部分的體外離體研究。
　　 第二部分：C5aR1在體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)
　　 主要通過新生小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)，免疫組化和Western blot等方法，檢測神經(jīng)干細(xì)胞在不同分化階段的表達(dá)變化，得到如下結(jié)果：
　　 1、成功體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞：分別從新生的正常小

7、鼠和C5aR1基因敲除小鼠腦內(nèi)，分離培養(yǎng)NSCs，能連續(xù)傳代30代并凍存保存原代NSCs。
　　 2、撤除生長因子bFGF和EGF后，NSCs能分化為不同類型的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。分化前的NSCs高表達(dá)nestin，分化后nestin表達(dá)降低。
　　 3、C5aR1在nestin陽性神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)有較高的表達(dá)，在NSCs分化后，C5aR1表達(dá)水平降低，但分化后細(xì)胞的細(xì)胞類型與C5aR1的表達(dá)無明顯相關(guān)性。
　　 以上

8、結(jié)果一方面說明我們掌握了NSCs體外培養(yǎng)方法，另一方面證實(shí)了在體外培養(yǎng)的NSCs內(nèi)有C5aR1的表達(dá)，C5aR1的表達(dá)對神經(jīng)于細(xì)胞的定向分化無明顯影響，我們推測，C5aR1可能參與調(diào)節(jié)NSCs的增殖過程，據(jù)此我們進(jìn)行下一步的研究。
　　 第三部分：C5aR1促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用
　　 為了研究C5aR1是否對NSCs的增殖具有影響，我們一方面利用C5aR1特異性拮抗肽干預(yù)體外培養(yǎng)的NSCs，通過免疫組化和細(xì)胞增殖分析

9、等技術(shù)，研究C5aR1對神經(jīng)干細(xì)胞分裂增殖的作用；另一方面，利用C5aR1基因敲除小鼠模型與野生型小鼠來源的神經(jīng)干細(xì)胞對比，結(jié)合活細(xì)胞動態(tài)觀察技術(shù)，分析兩種細(xì)胞的分裂能力和成球能力。得到如下的結(jié)果：
　　 1、在不同濃度(0～100ng/ml)的C5aR1特異性拮抗肽作用下，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力受到抑制，發(fā)現(xiàn)10ng/ml濃度的C5aR1拮抗肽的抑制作用最為明顯。
　　 2、在C5aR1拮抗肽作用下，神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)nest

10、in的表達(dá)受到抑制，BrdU陽性細(xì)胞明顯減少。
　　 3、來源于C5aR1基因敲除小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力和成球能力明顯低于野生型小鼠來源的NSCs。
　　
　　 4、活細(xì)胞技術(shù)觀察到C5aR1基因敲除，延遲體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的分裂時間。
　　 這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)C5aR1拮抗肽抑制nestin表達(dá)，減弱NSCs的增殖能力，C5aR1基因敲除影響了NSCs的分裂和神經(jīng)球的形成，表明C5aR1對維持NSCs的