表達Anhinga株HN基因嵌合病毒的構(gòu)建及其抗腫瘤效果的研究.pdf

1、新城疫病毒(NDV)為單股不分節(jié)段的負鏈RNA病毒，屬副粘病毒科、禽副粘病毒屬。19世紀20年代，有研究報道NDV能殺傷腫瘤細胞，1964年，NDV首次被用于癌癥的治療，從此NDV作為一種潛在的腫瘤治療生物制劑引起了人們的關(guān)注，成為腫瘤研究領域的熱點之一。根據(jù)該病毒對易感動物雞的致病力將NDV分為強毒株、中毒株和弱毒株。強毒株溶瘤效果好，但對生態(tài)造成威脅，影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展;弱毒株對生物環(huán)境友好，對家禽沒有致病作用，但溶瘤效果較差。選擇什

2、么樣的毒株作為腫瘤治療制劑一直是該研究領域難以決定的重大問題。最理想的選擇是提高弱毒株的溶瘤效果，而不改變病毒的毒力。以往的研究表明NDV的F基因是決定病毒溶瘤效果的關(guān)鍵基因，但是F基因的溶瘤效果與病毒的毒力密切相關(guān)。多項研究結(jié)果顯示，當使用強毒株的F基因替換弱毒株的F基因時，NDV溶瘤活性增加，但是同時受體病毒的毒力大幅度提高，甚至可以達到強毒株的毒力。這些結(jié)果排除了用F基因提高弱毒株溶瘤效果的可能性。
　　最近美國東南禽病研究

3、所Qingzhong Yu團隊報道了NDV Anhinga毒株的HN基因的突變顯著提高了該病毒形成合胞體的能力，說明除F基因外，HN基因可能也是決定病毒溶瘤效果的重要因素。NDV的HN蛋白是一個多功能蛋白，其在病毒的感染過程中扮演著十分重要的角色。HN蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種活性，可以識別細胞表面的唾液酸受體從而促進F蛋白的融合作用。但是，HN基因引起溶瘤效果與病毒致病力的關(guān)系還未見報道。本研究旨在用中毒Anhinga的HN基因替

4、換弱毒株Clone30的HN基因，觀察是否能提高弱毒株的溶瘤效果、如能提高弱毒株的溶瘤效果，是否增加弱毒株的對易感動物的致病力，為研制安全、有效（即提高NDV的溶瘤效果，而保持弱毒株的安全性）的溶瘤病毒制劑奠定理論基礎。
　　為了在DNA水平置換中毒株Anhinga的HN基因，本研究首先應用反向遺傳操作技術(shù)克隆弱毒株Clone30的全長基因組。采取了“分段克隆”的策略。在構(gòu)建cDNA克隆時，將NDV Clone30全基因組分成部分

5、重疊的十個片段，利用重疊部分的酶切位點將這十個片段依次克隆到低拷貝質(zhì)粒PFLC中，并在基因組3523bp、12357bp位置上進行定點突變，作為分子標簽用于鑒定拯救出的病毒。本實驗采取的是不依賴于輔助病毒的完全質(zhì)粒操作系統(tǒng)，并使用穩(wěn)定表達T7聚合酶的BHK-21細胞作為轉(zhuǎn)染細胞。拯救獲得的重組病毒通過雞胚進行增殖并收集尿囊液進行后續(xù)實驗，重組病毒命名為新城疫rClone30。然后用中毒株Anhinga(Anh)的HN基因替換了弱毒株Cl

6、one30的HN基因，構(gòu)建了重組嵌合病毒rClone30-Anh(HN)。首先將HN基因的PCR產(chǎn)物亞克隆入感染性克隆pClone30載體，與輔助質(zhì)粒NP、P和L共同轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，37℃培養(yǎng)72h后，于-80℃凍融三次收取細胞上清，接種9-11日齡的SPF雞胚。繼續(xù)培養(yǎng)72h后，收獲得雞胚尿囊液，即為嵌合病毒rClone30-Anh(HN)。
　　對嵌合病毒rClone30-Anh(HN)的生物學特性分析顯示，嵌合病毒和親

7、本毒株具有相同的生長動力學曲線，即HN基因的替換并沒有影響Clone30的復制。嵌合病毒的HA效價(24)低于親本毒株Clone30(29)與供體株Anh相似(24)。同時，與親本毒株相比嵌合病毒在引起細胞融合的能力上明顯增強，表現(xiàn)在嵌合病毒感染的HepG2細胞單層中產(chǎn)生較大的合胞體。對嵌合病毒rClone30-Anh(HN)的毒力和致病力分析顯示，rClone30-Anh(HN)與親本毒株在半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50=3.95×

8、107)、平均死亡時間(MDT＞120h)和雞胚半數(shù)感染量(EID50=1.8×108)上沒有顯著區(qū)別。嵌合病毒腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為0.08略高于親本毒株(ICPI=0)，但仍屬于弱毒株(ICPI=0-0.5)。實驗結(jié)果表明HN基因的替換沒有對Clone30毒力和致病力造成明顯的影響。在細胞水平上，對嵌合病毒rClone30-Anh(HN)抑制腫瘤能力進行分析。MTT結(jié)果顯示與親本毒株相比，rClone30-Anh(HN)表現(xiàn)出對

9、人肝癌細胞HepG2更為顯著的細胞毒性作用。通過對兩種病毒感染的HepG2細胞進行AnnexinⅤ-PI檢測、Rhodamine123染色和Caspase3基因轉(zhuǎn)錄水平分析，結(jié)果表明HN基因的替換顯著提高了嵌合病毒rClone30-Anh(HN)誘導腫瘤細胞凋亡的能力。利用兩種病毒對鼠源肝癌H22荷瘤小鼠進行治療，結(jié)果表明與親本毒株相比rClone30-Anh(HN)治療組的小鼠腫瘤體積明顯縮小，腫瘤病理切片顯示該治療組的腫瘤內(nèi)出現(xiàn)了較

10、為嚴重的T細胞浸潤和壞死。實驗證明HN基因的替換提高了Clone30株在體內(nèi)的抑瘤效果。
　　綜上所述，本研究構(gòu)建了表達中毒株Anhinga的HN基因的重組弱毒株Clone30嵌合病毒rClone30-Anh(HN)。該嵌合病毒在毒力和致病性與親本毒株相似，但顯著提高了嵌合病毒的抑瘤活性。這些結(jié)果為研制溶瘤效果好，致病力低，安全有效的溶瘤病毒提供了一個嶄新的思路。同時得到的嵌合病毒rClone30-Anh(HN)有望取代親本病毒C