鵝源副黏病毒HN基因真核表達(dá)質(zhì)粒在小鼠中的免疫效果.pdf

1、鵝副黏病毒病是由鵝源副黏病毒(Goose Paramyxovirus，GPMV)引起的鵝的一種急性、烈性傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的危害。目前，臨床上對(duì)GPMV感染尚無(wú)特效的治療藥物，接種疫苗是預(yù)防和控制該病發(fā)生的主要手段。由于傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗存在著免疫原性較弱和毒力返祖等問(wèn)題，因此，開(kāi)發(fā)研制新型疫苗勢(shì)在必行。隨著分子生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)，制備基因工程疫苗，預(yù)防和控制該病成為研究熱點(diǎn)

2、。 GPMV為有囊膜單鏈負(fù)股不分節(jié)段RNA病毒，由6種結(jié)構(gòu)蛋白組成：NP(核衣殼蛋白)、P(磷蛋白)、M(基質(zhì)蛋白)、F(融合蛋白)、HN(血凝素-神經(jīng)氨酸酶)、L(高分子量的RNA聚合酶)，其中，HN蛋白是該病毒的主要保護(hù)性抗原之一。HN蛋白具有HA和NA兩種活性，前者(血凝素)負(fù)責(zé)識(shí)別靶細(xì)胞含唾液酸的受體，并介導(dǎo)病毒對(duì)靶細(xì)胞的吸附，神經(jīng)氨酸則具有分解、破壞受體的能力，并促使新生的病毒粒子從感染的細(xì)胞膜上釋放，這兩種活性對(duì)于

3、病毒侵染細(xì)胞都具有重要的作用。因此，構(gòu)建含有主要保護(hù)性抗原HN基因的真核表達(dá)載體，對(duì)預(yù)防該病具有重要意義。 本研究旨在完成鵝源副黏病毒吉林分離株部分生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，將本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建的HN基因真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXⅠ-HN和空載體pVAXⅠ，通過(guò)堿裂解法進(jìn)行大量提取，免疫BALB/c小鼠，觀察免疫效果。 將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，分別設(shè)為pVAXⅠ-HN質(zhì)粒試驗(yàn)組，pVAXⅠ空質(zhì)粒對(duì)照組和生

4、理鹽水陰性對(duì)照組。免疫四次后殺鼠，無(wú)菌分離小鼠脾細(xì)胞，利用MTT法檢測(cè)免疫小鼠的T細(xì)胞增殖活性；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量；分離小鼠血清，利用雙方陣法建立間接ELISA反應(yīng)條件，檢測(cè)小鼠血清中GPMV抗體。 MTT結(jié)果表明，試驗(yàn)組與兩組對(duì)照組的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)刺激指數(shù)(SI)差異不顯著，其SI值統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別為1.18±0.03、1.12±0.04和1.16±0.03。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，試

5、驗(yàn)組與兩組對(duì)照組的CD3+、CD4+及CD8+T細(xì)胞數(shù)量差異均不顯著，其中，CD3+數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別為40.66％±1.43％、41.07％±4.72％和40.94％±5.32％，CD4+數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別26.00％±1.83％、25.32％±2.89％和25.77％±4.01％，CD8+數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別為12.55％±1.19％、12.79％±2.08％和12.42％±1.87％。采用雙方陣法，經(jīng)反復(fù)摸索，最終確定建立GPMV特異性抗

6、體的間接ELISA反應(yīng)條件：抗原最佳包被濃度為30μg/mL，抗體最佳稀釋度為1：400，羊抗鼠酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1：5000。采用上述反應(yīng)條件，測(cè)定各組小鼠OD492值，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組小鼠血清中GPMV特異性抗體水平顯著高于空載體對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，ELISA試驗(yàn)OD492的統(tǒng)計(jì)值分別為1.36±0.10、0.36±0.02和0.31±0.02。 由此說(shuō)明，GPMV HN基因真核表達(dá)質(zhì)粒可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫，