鵝源副黏病毒HN基因真核表達質粒在小鼠中的免疫效果.pdf

1、鵝副黏病毒病是由鵝源副黏病毒(Goose Paramyxovirus，GPMV)引起的鵝的一種急性、烈性傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來了嚴重的危害。目前，臨床上對GPMV感染尚無特效的治療藥物，接種疫苗是預防和控制該病發(fā)生的主要手段。由于傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗存在著免疫原性較弱和毒力返祖等問題，因此，開發(fā)研制新型疫苗勢在必行。隨著分子生物學等相關技術的發(fā)展，利用基因工程技術，制備基因工程疫苗，預防和控制該病成為研究熱點

2、。 GPMV為有囊膜單鏈負股不分節(jié)段RNA病毒，由6種結構蛋白組成：NP(核衣殼蛋白)、P(磷蛋白)、M(基質蛋白)、F(融合蛋白)、HN(血凝素-神經(jīng)氨酸酶)、L(高分子量的RNA聚合酶)，其中，HN蛋白是該病毒的主要保護性抗原之一。HN蛋白具有HA和NA兩種活性，前者(血凝素)負責識別靶細胞含唾液酸的受體，并介導病毒對靶細胞的吸附，神經(jīng)氨酸則具有分解、破壞受體的能力，并促使新生的病毒粒子從感染的細胞膜上釋放，這兩種活性對于

3、病毒侵染細胞都具有重要的作用。因此，構建含有主要保護性抗原HN基因的真核表達載體，對預防該病具有重要意義。 本研究旨在完成鵝源副黏病毒吉林分離株部分生物學特性研究的基礎上，將本實驗室成功構建的HN基因真核表達質粒pVAXⅠ-HN和空載體pVAXⅠ，通過堿裂解法進行大量提取，免疫BALB/c小鼠，觀察免疫效果。 將30只BALB/c小鼠隨機分成3組，每組10只，分別設為pVAXⅠ-HN質粒試驗組，pVAXⅠ空質粒對照組和生

4、理鹽水陰性對照組。免疫四次后殺鼠，無菌分離小鼠脾細胞，利用MTT法檢測免疫小鼠的T細胞增殖活性；用流式細胞術檢測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量；分離小鼠血清，利用雙方陣法建立間接ELISA反應條件，檢測小鼠血清中GPMV抗體。 MTT結果表明，試驗組與兩組對照組的淋巴細胞增殖試驗刺激指數(shù)(SI)差異不顯著，其SI值統(tǒng)計結果分別為1.18±0.03、1.12±0.04和1.16±0.03。流式細胞術檢測結果顯示，試

5、驗組與兩組對照組的CD3+、CD4+及CD8+T細胞數(shù)量差異均不顯著，其中，CD3+數(shù)量統(tǒng)計結果分別為40.66％±1.43％、41.07％±4.72％和40.94％±5.32％，CD4+數(shù)量統(tǒng)計結果分別26.00％±1.83％、25.32％±2.89％和25.77％±4.01％，CD8+數(shù)量統(tǒng)計結果分別為12.55％±1.19％、12.79％±2.08％和12.42％±1.87％。采用雙方陣法，經(jīng)反復摸索，最終確定建立GPMV特異性抗

6、體的間接ELISA反應條件：抗原最佳包被濃度為30μg/mL，抗體最佳稀釋度為1：400，羊抗鼠酶標二抗最佳稀釋度為1：5000。采用上述反應條件，測定各組小鼠OD492值，結果顯示，試驗組小鼠血清中GPMV特異性抗體水平顯著高于空載體對照組和生理鹽水對照組，ELISA試驗OD492的統(tǒng)計值分別為1.36±0.10、0.36±0.02和0.31±0.02。 由此說明，GPMV HN基因真核表達質?？梢哉T導小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫，