PRRSV HuN4株和CH-1a株感染性克隆及其嵌合病毒的構(gòu)建及其初步應(yīng)用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種病毒性傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病，因其可引起發(fā)病豬耳部發(fā)紺成藍(lán)紫色，俗稱藍(lán)耳病。目前我國(guó)流行的高致病性藍(lán)耳?。℉P-PRRS）比經(jīng)典PRRS致病性更高，危害更大。雖然對(duì)PRRSV進(jìn)行了廣泛的研究，但決定其復(fù)制和毒力等的相關(guān)機(jī)制尚不夠清楚。感染性克隆是研究PRRSV的重要操作平臺(tái)，目前大部分的PRRSV感染性克隆是基于體外轉(zhuǎn)錄

2、的，這不僅降低了拯救的效率，而且增加了病毒拯救的復(fù)雜程度。
　　為高效快速地拯救PRRSV，本研究開(kāi)展了基于真核啟動(dòng)子的PRRSV反向遺傳的構(gòu)建。通過(guò)RT-PCR方法分段擴(kuò)增了高致病性PRRSV HuN4-F5和經(jīng)典PRRSV CH-1a的全長(zhǎng)基因組片段，克隆至含β-actin真核啟動(dòng)子的低拷貝載體pOKM中，成功構(gòu)建了pOK-HuN4和pOK-Ch兩個(gè)全長(zhǎng)基因組克隆，經(jīng)直接轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，成功拯救出相應(yīng)的病毒。其中pO

3、K-CH的成功構(gòu)建為PRRSV CH-1a株的保種提供了保證。同時(shí)在pOK-HuN4和pOK-CH的基礎(chǔ)上，分別對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行互換，構(gòu)建了6株嵌合病毒，即以結(jié)構(gòu)蛋白互換的 pOK-HuN4nsp-CHsp和pOK-CHnsp-HuN4sp，非結(jié)構(gòu)蛋白開(kāi)放閱讀框互換的 pOK-HuN4-CHORF1a、pOK-CH-HuN4ORF1a、pOK-HuN4-CHORF1b和pOK-CH-HuN4ORF1b，并成功拯救出這6株嵌合

4、病毒。在pOK-HuN4的基礎(chǔ)上在其ORF7和3’-UTR之間插入海腎熒光素酶報(bào)告基因，經(jīng)拯救后，可檢測(cè)到熒光信號(hào)，為PRRSV的復(fù)制監(jiān)測(cè)及中和抗體水平檢測(cè)等方面提供了應(yīng)用技術(shù)。
　　基于真核啟動(dòng)子的HP-PRRSV HuN4和PRRSV CH-1a株感染性克隆的構(gòu)建，避免了RNA的體外轉(zhuǎn)錄，簡(jiǎn)化了病毒的拯救過(guò)程，提高了病毒拯救的成功率。在此基礎(chǔ)上完成了帶有海腎熒光素酶報(bào)告基因的pOK-HuN4-Rlu以及一系列嵌合毒的構(gòu)建為今后