鴨星狀病毒1型D51株DNA-launched感染性克隆的構(gòu)建與病毒拯救.pdf

1、星狀病毒（Astrovirus,AstV）是一種感染人及豬、牛、蝙蝠、犬、貓等哺乳動(dòng)物和雞、火雞、鴿子等鳥(niǎo)類的腸道疾病相關(guān)病原。鴨星狀病毒屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬，是一種單股正鏈、沒(méi)有囊膜的RNA病毒。3周齡以內(nèi)的雛鴨易感，不同于其他的禽星狀病毒，鴨星狀病毒可以導(dǎo)致鴨的致死性的病毒性肝炎，表現(xiàn)為肝臟出血，抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀。最近幾年研究發(fā)現(xiàn)，鴨星狀病毒和鴨甲肝病毒混合感染的情況頻繁出現(xiàn)，使鴨病毒性肝炎的防治難度進(jìn)一步增加。為了深

2、入了解鴨星狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能以及致病機(jī)理等，本研究的目的是構(gòu)建鴨星狀病毒I型（Duck astrovirus type1,DAstV-1）D51株cDNA DNA-lauched感染性克隆，對(duì)拯救病毒在BHK-21細(xì)胞中的增殖情況進(jìn)行探究，并對(duì)D51拯救病毒在鴨子體內(nèi)的分布情況利用熒光定量的方法進(jìn)行了檢測(cè)。
　　1.ORF2蛋白的原核表達(dá)及抗DAstV-1血清的制備
　　為了進(jìn)行DAstV-1的IFA鑒定，本研究需要制

3、備抗DAstV-1血清。首先將DAstV-1的衣殼蛋白基因（ORF2）分三段克隆到原核表達(dá)載體pET-32a中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白。將融合蛋白與弗氏完全佐劑混合后免疫BALB/C老鼠，分別間隔兩周后，將融合蛋白與弗氏不完全佐劑混合后進(jìn)行二免、三免，三免十天后采血離心后得到三份抗血清，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗血清3的P/N值最大，適于進(jìn)行DAstV-1的IFA鑒定。
　　2.DAstV-1 D51株傳染性克隆的構(gòu)

4、建以及病毒的拯救
　　在本實(shí)驗(yàn)室已完成的DAstV-1 D51株全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上，根據(jù)pABX.載體序列、核酶序列和病毒全基因組序列的酶切圖譜，設(shè)計(jì)并合成四對(duì)特異性引物，將已有的11段片段通過(guò)融合PCR的方法融合成四段A、B、C、D，通過(guò)引物的形式把核酶序列分別添加在第一段的前端和第四段的末端，并在末端添加病毒基因組序列中不存在的單一酶切位點(diǎn)Xhol。首先將A、B片段分別連接在pEASY-T1載體上，C、D片段連接在pMD18-

5、T載體上；然后將A、B片段通過(guò)AscI、BamHI酶切位點(diǎn)連在同一個(gè)pEASY-T1載體上；最后，通過(guò)特異的酶切位點(diǎn)依次將AB、C、D片段依次連接在克隆載體中，組成了一個(gè)包含全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒，并將其命名為pABX-DAstV。另外設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于突變一個(gè)堿基（6234為C突變?yōu)門）形成BglII酶切位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)簽，用于區(qū)分母本病毒和拯救病毒。將獲得的pABX-DAstV質(zhì)粒測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)有1個(gè)堿基發(fā)生突變，而且是人為突變，氨基酸并沒(méi)

6、有發(fā)生變化。將大量提取的去毒素重組質(zhì)粒pABX-DAstV轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用滅菌PBS作陰性對(duì)照。用RT-PCR和IFA方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。通過(guò)鑒定突變的遺傳標(biāo)記，表明已經(jīng)成功獲得了拯救病毒。
　　3.D51毒株在細(xì)胞中增殖的探究
　　由于沒(méi)有合適的細(xì)胞系可以增殖星狀病毒，因此對(duì)星狀病毒的研究具有一定的局限性。由于人星狀病毒可以在胰酶存在的情況下進(jìn)行增殖，本研究摸索了鴨星狀病毒的傳代方法。將DNA-launched感

7、染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)之后，反復(fù)凍融三次，用200μg/mL的trypsin在37℃處理1h，然后將細(xì)胞毒用胰酶抑制劑處理1h，加到長(zhǎng)到80％匯合度細(xì)胞的細(xì)胞瓶中孵育1h，之后換上含3μg/mL trypsin的不含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并可傳代。
　　4.SYBR Green I熒光定量PCR方法的建立與應(yīng)用
　　通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物建立了檢測(cè)DAstV-1的SYBR Green I熒光定量PCR方法

8、。建立了檢測(cè) DAstV-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在7.3×109～7.3×102 copies/μL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=-3.4811x+38.429，相關(guān)系數(shù)分別為0.999，PCR循環(huán)效率分別為94.4%，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的重復(fù)性和特異性，靈敏度為73copies/PCR。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞得到的拯救病毒，接種2日齡的健康雛鴨，分別在接種后24h、36h、48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取其心、肝、脾、腎、胸腺、法

9、氏囊、小腸七個(gè)器官用建立的熒光定量方法進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果表明每個(gè)器官中都可以檢測(cè)到拯救病毒，顯示拯救病毒可以在鴨子體內(nèi)多個(gè)不同的組織器官中增殖。
　　星狀病毒（Astrovirus,AstV）是一種感染人及豬、牛、蝙蝠、犬、貓等哺乳動(dòng)物和雞、火雞、鴿子等鳥(niǎo)類的腸道疾病相關(guān)病原。鴨星狀病毒屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬，是一種單股正鏈、沒(méi)有囊膜的RNA病毒。3周齡以內(nèi)的雛鴨易感，不同于其他的禽星狀病毒，鴨星狀病毒可以導(dǎo)致鴨的致死性的病毒

10、性肝炎，表現(xiàn)為肝臟出血，抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀。最近幾年研究發(fā)現(xiàn)，鴨星狀病毒和鴨甲肝病毒混合感染的情況頻繁出現(xiàn)，使鴨病毒性肝炎的防治難度進(jìn)一步增加。為了深入了解鴨星狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能以及致病機(jī)理等，本研究的目的是構(gòu)建鴨星狀病毒I型（Duck astrovirus type1,DAstV-1）D51株cDNA DNA-lauched感染性克隆，對(duì)拯救病毒在BHK-21細(xì)胞中的增殖情況進(jìn)行探究，并對(duì)D51拯救病毒在鴨子體內(nèi)的分布情況

11、利用熒光定量的方法進(jìn)行了檢測(cè)。
　　1.ORF2蛋白的原核表達(dá)及抗DAstV-1血清的制備
　　為了進(jìn)行DAstV-1的IFA鑒定，本研究需要制備抗DAstV-1血清。首先將DAstV-1的衣殼蛋白基因（ORF2）分三段克隆到原核表達(dá)載體pET-32a中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白。將融合蛋白與弗氏完全佐劑混合后免疫BALB/C老鼠，分別間隔兩周后，將融合蛋白與弗氏不完全佐劑混合后進(jìn)行二免、三免，三

12、免十天后采血離心后得到三份抗血清，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗血清3的P/N值最大，適于進(jìn)行DAstV-1的IFA鑒定。
　　2.DAstV-1 D51株傳染性克隆的構(gòu)建以及病毒的拯救
　　在本實(shí)驗(yàn)室已完成的DAstV-1 D51株全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上，根據(jù)pABX.載體序列、核酶序列和病毒全基因組序列的酶切圖譜，設(shè)計(jì)并合成四對(duì)特異性引物，將已有的11段片段通過(guò)融合PCR的方法融合成四段A、B、C、D，通過(guò)引物的形式把核酶序列分別添加在第一段的

13、前端和第四段的末端，并在末端添加病毒基因組序列中不存在的單一酶切位點(diǎn)Xhol。首先將A、B片段分別連接在pEASY-T1載體上，C、D片段連接在pMD18-T載體上；然后將A、B片段通過(guò)AscI、BamHI酶切位點(diǎn)連在同一個(gè)pEASY-T1載體上；最后，通過(guò)特異的酶切位點(diǎn)依次將AB、C、D片段依次連接在克隆載體中，組成了一個(gè)包含全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒，并將其命名為pABX-DAstV。另外設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于突變一個(gè)堿基（6234為C突變?yōu)門

14、）形成BglII酶切位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)簽，用于區(qū)分母本病毒和拯救病毒。將獲得的pABX-DAstV質(zhì)粒測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)有1個(gè)堿基發(fā)生突變，而且是人為突變，氨基酸并沒(méi)有發(fā)生變化。將大量提取的去毒素重組質(zhì)粒pABX-DAstV轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用滅菌PBS作陰性對(duì)照。用RT-PCR和IFA方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。通過(guò)鑒定突變的遺傳標(biāo)記，表明已經(jīng)成功獲得了拯救病毒。
　　3.D51毒株在細(xì)胞中增殖的探究
　　由于沒(méi)有合適的細(xì)胞系可以增殖

15、星狀病毒，因此對(duì)星狀病毒的研究具有一定的局限性。由于人星狀病毒可以在胰酶存在的情況下進(jìn)行增殖，本研究摸索了鴨星狀病毒的傳代方法。將DNA-launched感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)之后，反復(fù)凍融三次，用200μg/mL的trypsin在37℃處理1h，然后將細(xì)胞毒用胰酶抑制劑處理1h，加到長(zhǎng)到80%匯合度細(xì)胞的細(xì)胞瓶中孵育1h，之后換上含3μg/mL trypsin的不含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并可傳代。
　　

16、4.SYBR Green I熒光定量PCR方法的建立與應(yīng)用
　　通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物建立了檢測(cè)DAstV-1的SYBR Green I熒光定量PCR方法。建立了檢測(cè) DAstV-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在7.3×109～7.3×102 copies/μL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=-3.4811x+38.429，相關(guān)系數(shù)分別為0.999，PCR循環(huán)效率分別為94.4%，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的重復(fù)性和特異性，靈敏度為73cop