miRNA-145基因穩(wěn)定轉染肺腺癌細胞株的建立及其增殖侵襲能力的實驗研究.pdf

1、目的：
　　建立穩(wěn)定過表達、沉默表達及空載表達miRNA-145基因的人肺腺癌A549細胞株，并驗證miRNA-145在A549細胞中增殖和侵襲能力的影響。
　　方法：
　　1.建立miRNA-145基因穩(wěn)定轉染A549細胞株。通過G418篩選實驗確定G418最佳篩選濃度；將含有過表達、沉默表達及空載表達miRNA-145基因的重組質(zhì)粒，應用陽離子脂質(zhì)體介導的方法轉染入人肺腺癌A549細胞，并通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光

2、蛋白的方法以及應用流式細胞儀直接測定轉染效率，經(jīng)G418加壓篩選，得到穩(wěn)定過表達miRNA-145基因的新肺腺癌細胞株（命名為A549/H）、沉默表達miRNA-145基因的新肺腺癌細胞株（命名為A549/L）及空載表達miRNA-145基因的新肺腺癌細胞株（命名為A549/E）。按照試劑盒進行miRNA的提取和逆轉錄，miRNA-145和U6引物均為廣州佰而林公司設計及合成。設置反應條件后進行實時熒光定量PCR反應，反應結束后應用軟件

3、進行數(shù)據(jù)分析，得出擴增曲線和熔解曲線。對比穩(wěn)定轉染后各實驗組的miRNA-145基因表達量，以確保獲得穩(wěn)定轉染的細胞株。
　　2.驗證過表達穩(wěn)定轉染后A549/H細胞的增殖及侵襲能力的變化。實驗分組：A549/H細胞；A549/E細胞；A549細胞。應用CCK8法檢測三組細胞存活生長情況：觀察三組細胞的生長曲線，研究比較A549/H細胞的增殖能力的變化。通過Transwell細胞侵襲實驗檢測三組細胞的體外侵襲能力的變化。
　

4、　結果：
　　1.通過G418篩選最佳濃度測定實驗，最終確定200μg/ml的G418濃度為篩選濃度。
　　2.通過計數(shù)發(fā)綠色熒光的細胞及流式細胞儀檢測細胞轉染效率，過表達組、沉默表達組及空載表達組細胞轉染效率均約為80％。
　　3.qRT-PCR結果顯示：與A549細胞組相比，A549/H細胞內(nèi)miRNA-145明顯升高（P<0.05），A549/L細胞內(nèi)miRNA-145明顯降低（P<0.05），而A549/E和A

5、549細胞相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　4.CCK8法實驗結果示：A549/H組，A549/E組及A549組細胞生長24h后，OD值分別為0.624、0.709、0.690；48h后，OD值分別為0.703、0.777、0.763；72h后，OD值分別為0.724、0.794、0.779；96h后，OD值分別為0.759、0.834、0.825。與A549組相比，A549/H組細胞在第24h，48h，72h，96h的細胞

6、OD值顯著降低。與A549組相比，A549/H組細胞增殖能力明顯減弱（P<0.05），而A549/E組和A549組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　5.Transwell腫瘤細胞侵襲實驗結果示：A549/H組，A549/E組及A549組三組細胞穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)為：A549/H組41個，A549/E組73個，A549細胞組81個。與A549組相比，A549/H組細胞侵襲能力顯著下降（P<0.05），而A549/E組和A5