siRNA沉默Sox-9基因?qū)趋扛杉毎飳W(xué)性狀影響的實驗研究.pdf

1、目的：探討siRNA沉默Sox-9基因?qū)趋扛杉毎鲋场⒌蛲黾跋蜍浌欠较蚍只壬飳W(xué)性狀的影響，了解Sox-9基因?qū)趋扛杉毎毎蜃覲THrP、Ihh及軟骨細胞外基質(zhì)如Col2α1、aggrecan調(diào)控的相關(guān)分子機制。
　　 方法：在顯微手術(shù)方法輔助下，從新生24小時內(nèi)的SD大鼠股骨干骺端的軟骨膜環(huán)（La CroiX環(huán)）中采用酶消化法分離、免疫磁珠法純化、并利用細胞相對特異性標(biāo)志物FGFR-3進行免疫組化和免疫熒光鑒定得到骨骺

2、干細胞；選擇生長狀態(tài)良好的細胞首先進行轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的Sox-9 siRNA，熒光顯微鏡下觀察判斷轉(zhuǎn)染效率，確定最佳轉(zhuǎn)染條件，進一步進行實驗分組，共分成2組：第1組空白對照組：常規(guī)培養(yǎng)細胞；第2組實驗干預(yù)組：Sox-9 siRNA通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染干擾骨骺干細胞。分組實驗操作后繼續(xù)培養(yǎng)，于24h、48h、72h三個時間點用MTT檢測細胞增殖情況，于培養(yǎng)后48h流式技術(shù)Annexin_V-FITC&PI進行凋亡檢測

3、、RT-PCR檢測Sox-9、Col2α1、aggrecan、PTHrP、Ihh指標(biāo)表達變化。根據(jù)實驗結(jié)果評價Sox-9 siRNA轉(zhuǎn)染效率及其干擾Sox-9基因?qū)趋扛杉毎鲋?、凋亡及向軟骨方向分化的影響?br>　　 結(jié)果：1.分離、純化得到生長狀態(tài)穩(wěn)定、貼壁牢固的原代骨骺干細胞，鏡下多呈梭形；2.免疫組化、免疫熒光鑒定顯示細胞穩(wěn)定表達相對特異性標(biāo)志物FGFR-3；3.轉(zhuǎn)染預(yù)實驗顯示所有轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率均在80％以上，可以做后續(xù)實驗

4、；4.MTT檢測結(jié)果顯示實驗組細胞增殖較對照組降低（p＜0.05）；5.流式凋亡檢測顯示實驗組較對照組凋亡增加；6.RT-PCR檢測結(jié)果顯示實驗組Sox-9、Col2α1、aggrecan、PTHrP表達較空白對照組降低，Ihh表達無明顯改變。
　　 結(jié)論：siRNA通過轉(zhuǎn)染可高效沉默骨骺干細胞Sox-9基因表達，對其細胞增殖起抑制作用并促進細胞凋亡，且對軟骨細胞外基質(zhì)Col2α1、aggrecan基因表達有明顯的抑制作用，PT