Skp2基因沉默對人肺癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及機制研究.pdf

1、肺癌是一種常見惡性腫瘤，發(fā)病率高，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。20世紀(jì)80年代以來，肺癌的治療取得了較大的進展，手術(shù)、放療、化療和免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用，大大提高了患者的5年生存率。但手術(shù)、放療和化療并發(fā)癥多、毒副作用大。尋找新的有效、簡便、毒副作用小的治療方法成為醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注的焦點。 目前方興未艾的基因治療可能成為很有前景的腫瘤治療方式之一，RNA干擾屬于基因治療的一種新的方式。RNA干擾(RNA interferenceRNAi)

2、現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于1995年，迅速引起研究者的重視。RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的、在轉(zhuǎn)錄后水平封閉或沉默相應(yīng)基因表達(dá)的基因阻斷技術(shù)，其原理是小片段RNA(siRNA)依據(jù)堿基互補的原理，特異性地結(jié)合癌基因的mRNA，干擾其翻譯、轉(zhuǎn)錄形成蛋白質(zhì)的功能，阻抑癌蛋白的生成，抑制癌細(xì)胞生長或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。RNA干擾已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因功能和各種腫瘤的治療的研究中。 腫瘤實質(zhì)上是一種細(xì)胞周期調(diào)控紊亂性疾病。細(xì)胞周期的

3、調(diào)控是一個及其復(fù)雜的過程，涉及到多因子、在多層次上的作用，在細(xì)胞周期調(diào)控中正性調(diào)控因子和負(fù)性調(diào)控因子之間的平衡失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞周期出現(xiàn)紊亂，而泛素蛋白酶體系統(tǒng)通過對多種類型的短壽命周期調(diào)控因子的降解，保持細(xì)胞周期運行中正負(fù)調(diào)控因子之間的平衡，保證細(xì)胞周期的順利運行，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Skp2屬于泛素蛋白酶體系統(tǒng)中F-box蛋白家族中一員，在泛素化降解蛋白質(zhì)過程中負(fù)責(zé)對底物蛋白的特異性識別，通過對多種靶蛋白的泛素化降解參與細(xì)胞周

4、期調(diào)控。 S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)是Zhang等人于1995年發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，因最初發(fā)現(xiàn)它在S期與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合的一種蛋白質(zhì)，所以命名為S期激酶相關(guān)蛋白。Skp2是泛素蛋白連接酶SCFSKP2的特異性識別底物的亞單位，屬于F-box的家庭成員。Skp2參與了對細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子p27、p21、p57、130/pRb2、E2F1、cyclin E和hOrclp等細(xì)胞周期因子的泛素化降解過程。Skp2通過促進細(xì)胞周期蛋白酶

5、抑制物p27、p21的降解，推動細(xì)胞周期從G期向S期轉(zhuǎn)換。研究發(fā)現(xiàn)Skp2過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)，近年來許多研究表明Skp2蛋白在許多惡性腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞的表達(dá)增高，而p27蛋白表達(dá)是降低的，兩者存在明顯的負(fù)相關(guān)。許多研究都證實Skp2具有癌基因的特性，Skp2的表達(dá)水平及活性與淋巴瘤，口腔鱗狀細(xì)胞癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，淋巴瘤，乳房癌，結(jié)腸癌，肺癌，胃癌的惡性程度、侵襲性、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。Skp2雖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，

6、但它調(diào)控細(xì)胞增殖以及在腫瘤中的發(fā)病機制仍不清楚。通過抑制Skp2表達(dá)，研究其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，了解與細(xì)胞周期調(diào)控因子之間的關(guān)系，對于揭示Skp2在細(xì)胞周期中的功能、在腫瘤中的發(fā)病機制及作為腫瘤治療的靶點的可行性都具有重要意義。 已有大量研究證實采用siRNA表達(dá)載體的方法能達(dá)到高效、特異抑制目的基因表達(dá)的效果，并且能延長對靶基因的抑制作用時間。因此本研究采用與siRNA表達(dá)載體相關(guān)的干擾技術(shù)，旨在探討Skp2 siRN

7、A表達(dá)載體對肺癌細(xì)胞內(nèi)源性Skp2基因的沉默作用?；赗NA干擾技術(shù)原理，構(gòu)建Skp2 siRNA質(zhì)粒質(zhì)粒載體，采用脂質(zhì)體包裹技術(shù)，將構(gòu)建的Skp2siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SPC-A-1肺癌細(xì)胞系，通過沉默肺癌細(xì)胞內(nèi)Skp2基因的表達(dá)，采用不同技術(shù)方法檢測構(gòu)建的Skp2 siRNA干擾質(zhì)粒對肺癌細(xì)胞增殖、生長、凋亡的影響，以及對接種的裸鼠腫瘤生長的抑制情況，探討Skp2siRNA表達(dá)載體作為肺癌基因治療新策略的可行性以及Skp2在肺癌發(fā)生、發(fā)

8、展中的機制。實驗分三部分： 第一部分： 目的：首先篩選出高表達(dá)Skp2基因的肺癌細(xì)胞，然后構(gòu)建Skp2siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，為Skp2基因功能研究打下實驗基礎(chǔ)。 方法：首先篩選出高表達(dá)Skp2基因的肺癌細(xì)胞株，作為下一步RNAi基因沉默的研究對象。采用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測兩株A549、SPC-A-1肺癌細(xì)胞株和Hela細(xì)胞中內(nèi)源性Skp2基因及蛋白的表達(dá)，篩選出高表達(dá)Skp2基因的肺癌細(xì)胞株。然后依

9、據(jù)RNA干擾原理，采用RNAi-DNA載體技術(shù)，以Skp2基因為靶點，設(shè)計、構(gòu)建、篩選靶向Skp2基因的小干擾RNA。根據(jù)人Skp2基因序列及二級結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計合成寡核普酸，將其插入pGenesil質(zhì)粒載體，構(gòu)建針對Skp2基因的RNA干涉真核表達(dá)載體。電泳法初步篩選正確的重組克隆。DNA測序驗證重組克隆插入序列的正確性。用構(gòu)建好的SkpZ siRNA表達(dá)載體脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染高表達(dá)Skp2的SPC-A-1肺癌細(xì)胞系，熒光鏡下檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

10、效率，G418篩選出陽性細(xì)胞克隆。取穩(wěn)定建株的克隆細(xì)胞，RT-PCR、Western blot檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的肺癌細(xì)胞內(nèi)Skp2 mRNA)及蛋白水平的變化。結(jié)果：RT-PCR、Westem blot檢測結(jié)果表明：SPC-A-1肺癌細(xì)胞和Hela細(xì)胞高表達(dá)Skp2，而A549肺癌細(xì)胞未檢測到Skp2的表達(dá)。酶切電泳分析和DNA測序證實重組質(zhì)粒Skp2 siRNA構(gòu)建成功；Skp2 siRNA對內(nèi)源Skp2基因的表達(dá)有明顯的抑制作用，明顯高

11、于對照組，抑制率達(dá)(71.2±5.5％)、(65.3±4.8％)；Skp2 siRNA對Skp2蛋白明顯抑制作用明顯，抑制率達(dá)(74.1±6.3％)、(67.2±5.5％)，與對照組及陰性質(zhì)粒對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：SPC-A-1肺癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)Skp2；構(gòu)建的重組質(zhì)粒Skp2siRNA能特異、高效抑制SPC-A-1細(xì)胞內(nèi)源性Skp2基因的表達(dá)，為下一步研究siRNA對肺癌細(xì)胞生長的影響打下實驗基礎(chǔ)。 第二部分：

12、 目的：探討采用RNAi技術(shù)抑制Skp2基因表達(dá)后，Skp2 siRNA重組質(zhì)粒對肺癌細(xì)胞生長、增殖的抑制情況，以及對細(xì)胞周期信號因子p27、p21的影響。 方法：MTT、流式細(xì)胞儀檢測Skp2 siRNA重組質(zhì)粒細(xì)胞組和對照組SPC-A-1細(xì)胞細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的變化。流式細(xì)胞學(xué)、TUNEL技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。免疫組化、激光共聚焦、Western blot檢測肺癌細(xì)胞內(nèi)p27、p21蛋白的表達(dá)改變。RT-PCR檢測p27

13、mRNA基因變化。 結(jié)果：Skp2 siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌SPC-A-1細(xì)胞后，細(xì)胞生長、增殖明顯被抑制，細(xì)胞凋亡增多。細(xì)胞周期檢測結(jié)果提示：轉(zhuǎn)染Skp2siRNA重組質(zhì)粒的細(xì)胞進入S期的比例減少，而阻滯在G0/G1期細(xì)胞比例增加。在轉(zhuǎn)染Skp2 siRNA重組質(zhì)粒的細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控因子p27、p21蛋白表達(dá)增強，而對照組及陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞增殖及p27、p21蛋白末見明顯改變。 結(jié)論：Skp2 siRNA重組質(zhì)

14、粒對肺癌細(xì)胞SPC-A-1的增殖有明顯抑制作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，抑制細(xì)胞內(nèi)Skp2表達(dá)后能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期調(diào)控因子p27、p21蛋白的表達(dá)。 第三部分： 目的：為探討構(gòu)建的Skp2 siRNA質(zhì)粒載體對體內(nèi)腫瘤生長的影響，采用轉(zhuǎn)染Skp2 siRNA質(zhì)粒肺癌細(xì)胞建立肺癌動物模型，觀察腫瘤生長情況。 方法：以BALB/c裸鼠為研究對象，采用皮下注射轉(zhuǎn)染Skp2 siRNA質(zhì)粒的SPC-A-1細(xì)胞和對照組細(xì)胞

15、懸液，建立肺癌細(xì)胞的裸鼠動物模型：通過觀察腫瘤形成時間，測量腫瘤體積和重量方法觀察腫瘤形成和腫瘤的生長狀況；采用免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測腫瘤組織Skp2蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染Skp2 siRNA質(zhì)粒的肺癌細(xì)胞接種裸鼠皮下后，腫瘤生長明顯減慢。與對照組相比，轉(zhuǎn)染Skp2 siRNA質(zhì)粒組腫瘤體積明顯縮小，Skp2蛋白下調(diào)(73.54±4.2％)、(67.3±3.2％)，而腫瘤內(nèi)細(xì)胞周期調(diào)控因子p27、p21