Notch和PTHrP雙信號系統(tǒng)調(diào)控骨骺干細胞增殖與分化及其機制的初步研究.pdf

1、第一部分Notch信號系統(tǒng)對骨骺干細胞生長的調(diào)控作用 實驗1骨骺干細胞的體外培養(yǎng)及生長特性觀察 目的：探討體外培養(yǎng)鼠骨骺干細胞及其生長特性觀察，為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：采用顯微取材后酶消化獲取骨骺干細胞，用Percoll密度梯度離心法純化，并測定其細胞生長曲線、細胞分裂指數(shù)、堿性磷酸酶活性，用免疫組化及免疫熒光染色的方法檢測Ⅱ、Ⅹ型膠原的合成情況和透射電鏡觀察粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的豐富程度。 結(jié)果：鼠骨骺干細胞形

2、狀類似成纖維細胞，呈梭型，堿性磷酸酶活性低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少，Ⅱ型膠原合成量較多。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的骨骺干細胞能向成熟階段分化，可為軟骨或骨組織工程提供理想的種子細胞。 實驗2Notch1信號系統(tǒng)對骨骺干細胞增殖與分化調(diào)控作用的初步觀察 目的：研究激活的Notch1信號系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的骨骺干細胞增殖與分化的調(diào)控作用。 方法：向體外培養(yǎng)的骨骺干細胞中分別加入Notch1激活劑rhNF-κB和抑制劑γ-secre

3、taseinhibitorⅡ(MW167)，空白對照加PBS緩沖液。用RT-PCR、免疫組化、MTT、流式細胞儀、堿性磷酸酶染色和WesternBlot方法檢測。 結(jié)果：骨骺干細胞中有Notch1和Jagged1表達；與對照組相比，rhNF-κB誘導組表達PCNA、CollagenⅡ蛋白明顯增多，促細胞增殖作用明顯(p=0.027)，并且進入分裂期(S期)細胞增多(26.54％)，而MW167誘導組堿性磷酸酶、CollagenⅩ

4、蛋白表達明顯增多，CollagenⅡ蛋白及分化標志蛋白stathmin表達明顯減少。結(jié)論：當Notch信號系統(tǒng)被激活時，骨骺干細胞進行增殖；當Notch信號系統(tǒng)被抑制時，骨骺干細胞進行分化。 實驗3激活的Notch1信號系統(tǒng)抑制骨骺干細胞凋亡及其機制研究 目的：研究激活的Notch1信號系統(tǒng)抑制體外培養(yǎng)的骨骺干細胞凋亡及其機制。 方法：用RT-PCR檢測骨骺干細胞中Notch信號系統(tǒng)的表達，并分別向培養(yǎng)細胞中加入

5、Notch1激活劑rhNF-kB、抑制劑γ-secretaseinhibitorⅡ(MW167)和Bcl-2抑制劑HA14-1，空白對照加PBS緩沖液，在凋亡誘導劑Celecoxib誘導后，用MTT檢測細胞活力、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和WesternBlot檢測Hes-1及Bcl-2蛋白的表達。 結(jié)果：骨骺干細胞中存在Notch1/Jagged1信號通路，rhNF-kB組細胞活力增加，凋亡較少，Hes-1蛋白和Bcl-2蛋白表達

6、明顯增加，而MW167組、HA14-1組和對照組細胞凋亡明顯，差異有顯著意義(p＜0.05)，且HA14-1組和HA14-1協(xié)同rhNF-kB組無Bcl-2表達。 結(jié)論：激活的Notch1信號系統(tǒng)通過促進靶基因Hes-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達來抑制骨骺干細胞凋亡。 實驗4Notch信號系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的鼠肢芽生長的調(diào)節(jié)作用 目的：研究Notch信號系統(tǒng)對體外培養(yǎng)器官生長的調(diào)節(jié)作用。 方法：體外培養(yǎng)孕1

7、6天鼠肢芽，通過測量其縱向生長長度、HE染色和甲苯胺藍染色觀察骨骺干細胞增殖與分化。 結(jié)果：與對照組相比，rhNF-κB實驗組鼠肢芽縱向生長遲緩，MW167實驗組縱向生長速度較快，差異有顯著意義(p＜0.05)。rhNF-κB實驗組表現(xiàn)出靜止區(qū)骨骺干細胞明顯增多，增殖區(qū)和肥大區(qū)成熟細胞所占比例較少；MW167實驗組表現(xiàn)出骨骺干細胞明顯處于分化狀態(tài)，靜止區(qū)骨骺干細胞非常少，增殖區(qū)和肥大區(qū)成熟軟骨細胞所占比例明顯增多。 結(jié)論

8、：激活的Notch信號系統(tǒng)不僅對體外培養(yǎng)的骨骺干細胞增殖、分化有調(diào)節(jié)作用，而且對肢體內(nèi)骨骺干細胞的增殖與分化也有調(diào)節(jié)作用。 第二部分Notch和PTHrP雙信號系統(tǒng)的調(diào)控作用 實驗5Notch和PTHrP雙信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)鼠骨骺干細胞增殖與分化及其機制研究 目的：研究Notch和PTHrP雙信號系統(tǒng)對骨骺干細胞生長的立體調(diào)節(jié)及其機制。 方法：通過免疫組化的方法檢測Notch、PTHrP和AP-1共表達；轉(zhuǎn)染P

9、THrP后MTT檢測PTHrP協(xié)同Notch促進骨骺干細胞增殖，Westernblot方法檢測PTHrP協(xié)同Notch抑制其分化及PTHrP和AP-1的表達。 結(jié)果：當Notch信號系統(tǒng)被激活時，明顯促進PTHrP和AP-1蛋白的表達；轉(zhuǎn)染PTHrP基因后，促進骨骺干細胞增殖作用明顯加強(p＜0.05)，collagenⅩ表達也明顯減少，明顯抑制骨骺干細胞分化；Notch被激活時，明顯促進AP-1和PTHrP表達，Notch被抑