Myostatin負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin)，簡(jiǎn)稱肌抑素，屬TGF-β超家族的一員，它是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。本研究旨在以小鼠成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞為模型，探討Myostatin負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)途徑。本研究共包括以下五部分實(shí)驗(yàn)： 實(shí)驗(yàn)一Myostatin對(duì)JNK信號(hào)途徑的影響 在掌握C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)特性的基礎(chǔ)上，為體外研究Myostatin是否對(duì)JNK信號(hào)途徑產(chǎn)生影響并確定

2、其最佳添加濃度，首先利用不同濃度的重組鼠Myostatin蛋白處理C2C12細(xì)胞，1h后收集細(xì)胞提取總蛋白，利用磷酸化JNK抗體進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果表明，添加50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白組的雜交信號(hào)最強(qiáng)。確定最佳添加濃度后，為進(jìn)一步研究細(xì)胞在增殖和分化過(guò)程中Myostatin是否對(duì)JNK信號(hào)途徑產(chǎn)生影響及了解這種影響是否具有時(shí)間效應(yīng)，分別在增殖和分化兩種培養(yǎng)條件下利用50ng/mL重組鼠Myostatin蛋

3、白處理C2C12細(xì)胞不同時(shí)間，然后在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞提取總蛋白，利用多種抗體進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果表明：增殖過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)JNK磷酸化水平在Myostatin作用20min出現(xiàn)輕微提高，在1h達(dá)到最大，隨后逐漸下降；分化過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)JNK磷酸化水平在Myostatin作用20min出現(xiàn)第一次提高，在40min回落到對(duì)照組水平，在1h后出現(xiàn)第二次提高并持續(xù)到4h；細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中，Myostatin激活JNK這一事件

4、被Myostatin激活c-Jun(JNK信號(hào)途徑下游信號(hào)分子)進(jìn)一步所證實(shí)，并且細(xì)胞內(nèi)c-Jun磷酸化水平的變化具有與JNK磷酸化水平變化相類似的規(guī)律；細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中，JNK總蛋白水平在各處理前后維持恒定。本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了C2C12細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中Myostatin能夠激活JNK信號(hào)途徑。 實(shí)驗(yàn)二ActRⅡB在Myostatin激活JNK中的作用 為獲得能夠有效下調(diào)ActRⅡB基因表達(dá)的小干擾RNA(siRN

5、A)分子，采用陽(yáng)性對(duì)照GAPDHsiRNA確定的最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件，將三對(duì)用于下調(diào)ActRⅡB基因表達(dá)的siRNA(AmbionsiRNAID59935、ID60120或ID162114)轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中，48h后收集細(xì)胞提取總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析細(xì)胞內(nèi)ActRⅡB基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明：和對(duì)照組相比，AmbionsiRNAID59935、ID60120和ID162114分別下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)ActRⅡB基因的mRN

6、A表達(dá)水平46.68％、27.46％和60.92％。為研究Myostatin激活JNK是否由ActRⅡB所介導(dǎo)，采用最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件，將AmbionsiRNAID162114轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中，48h后添加50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白處理1h，然后收集細(xì)胞提取總蛋白，利用磷酸化JNK抗體進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果表明，有效下調(diào)ActRⅡB基因表達(dá)后，Myostatin激活JNK的程度受到顯著地削弱。本實(shí)驗(yàn)證

7、實(shí)了Myostatin激活JNK是由ActRⅡB所介導(dǎo)。 實(shí)驗(yàn)三TAK1-MKK4信號(hào)通路在Myostatin激活JNK中的作用 為獲得能夠高效下調(diào)TAK1和MKK4基因表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)分子，采用最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件，分別將三對(duì)用于下調(diào)TAK1基因表達(dá)的siRNA(AmbionsiRNAID94455、ID94549或ID189006)和三對(duì)用于下調(diào)MKK4基因表達(dá)的siRNA(AmbionsiRNAID6

8、4447、ID64539或ID186583)轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中，48h后收集細(xì)胞提取總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析細(xì)胞內(nèi)TAK1和MKK4基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明：和對(duì)照組相比，AmbionsiRNAID94455、ID94549和ID189006分別下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)TAK1基因的mRNA表達(dá)水平33.34％、46.73％和79.97％，AmbionsiRNAID64447、ID64539和ID186583分別下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)MK

9、K4基因的mRNA表達(dá)水平85.19％、79.18％和69.59％。為研究Myostatin激活JNK是否由TAK1和MKK4所介導(dǎo)，采用最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件，分別將AmbionsiRNAID189006或AmbionsiRNAID64447轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中，48h后添加50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白處理1h，然后收集細(xì)胞提取總蛋白，利用多種抗體進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果表明，高效下調(diào)TAK1基因表達(dá)后，JNK

10、被Myostatin激活的程度受到削弱，而高效下調(diào)MKK4基因表達(dá)后，JNK幾乎不被Myostatin所激活。以上結(jié)果表明，Myostatin是通過(guò)TAK1-MKK4信號(hào)通路而激活JNK。 實(shí)驗(yàn)四JNK信號(hào)途徑在Myostatin負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化中的作用 采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖分析，結(jié)果表明：和對(duì)照組相比，添加50ng/mL重組Myostatin蛋白處理C2C12細(xì)胞24h抑制了細(xì)胞增殖約20％(P=0.28)

11、，而添加10μmol/LJNK特異性抑制劑SP600125阻斷JNK信號(hào)途徑后，Myostatin則失去了抑制細(xì)胞增殖的能力。Myostatin抑制成肌細(xì)胞增殖常與p21基因表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。為檢測(cè)細(xì)胞增殖過(guò)程中Myostatin是否對(duì)p21基因表達(dá)產(chǎn)生影響，實(shí)驗(yàn)對(duì)80％左右匯合的C2C12細(xì)胞用50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白分別處理2h、4h和6h。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，Myostatin上調(diào)p21基因表達(dá)最佳作用時(shí)

12、間為4h。為檢測(cè)細(xì)胞增殖過(guò)程中JNK是否在Myostatin上調(diào)p21基因表達(dá)中發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)對(duì)80％左右匯合的C2C12細(xì)胞用10μmol/LSP600125預(yù)先處理1h后，再用50ng/mL重組Myostatin蛋白處理4h。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，p21基因表達(dá)mRNA水平在Myostatin處理4h后上調(diào)了約3.5倍，而存在SP600125時(shí)，Myostatin上調(diào)p21基因表達(dá)的能力則受到一定程度的削弱。Westernbl

13、ot分別結(jié)果表明，p21基因表達(dá)蛋白水平的變化與其mRNA水平的變化類似。Myostatin抑制成肌細(xì)胞分化常與分化相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)。為檢測(cè)JNK是否在Myostatin下調(diào)分化相關(guān)基因表達(dá)中起作用，C2C12細(xì)胞在增殖培養(yǎng)液生長(zhǎng)至80％左右匯合時(shí)，更換為分化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后于分化培養(yǎng)條件下用10μmol/LSP600125預(yù)先處理1h后，再用50ng/mL重組Myostatin蛋白處理24h，分別利用實(shí)時(shí)熒光定量PC

14、R和Westernblot分析分化標(biāo)志基因myogenin和MyoD基因表達(dá)mRNA和蛋白水平的變化。結(jié)果表明，myogenin基因表達(dá)mRNA和蛋白水平分別在Myostatin處理24h后下調(diào)了40％和80％，MyoD基因表達(dá)mRNA和蛋白水平分別在Myostatin處理24h后下調(diào)了25％(P=0.13)和63％，而存在SP600125時(shí)，Myostatin下調(diào)myogenin和MyoD基因表達(dá)的能力均受到一定程度的削弱。以上結(jié)果表

15、明，JNK信號(hào)途徑在Myostatin負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮了重要作用。 實(shí)驗(yàn)五MKK4siRNA對(duì)Myostatin下調(diào)分化相關(guān)基因表達(dá)的影響 在分化培養(yǎng)條件下AmbionsiRNAID64447依然能夠高效下調(diào)MKK4基因表達(dá)的前提下，采用最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將MKK4基因特異的siRNA(AmbionsiRNAID64447)轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中，48h后更換成含50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白

16、的分化培養(yǎng)液再培養(yǎng)48h，然后收集細(xì)胞提取總蛋白，利用多種抗體進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)myogenin和MyoD蛋白水平在Myostatin作用48h分別下降了82.54％和90.02％，但采用RNAi顯著下調(diào)MKK4基因表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)myogenin和MyoD蛋白水平在Myostatin作用48h只分別下降了40.42％和24.38％。本實(shí)驗(yàn)一方面進(jìn)一步證實(shí)了JNK信號(hào)途徑在Myostatin負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞分化中

17、發(fā)揮了重要的作用，另一方面為尋求下調(diào)Myostatin活性提供了有益的思路。 總之，本研究首次揭示了Myostatin負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化的JNK信號(hào)途徑。首先，本研究證實(shí)了C2C12細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中Myostatin能夠激活JNK信號(hào)途徑。其次，本研究證實(shí)了Myostatin是通過(guò)ActRⅡB受體再通過(guò)TAK1-MKK4信號(hào)通路而激活JNK。最后，本研究證實(shí)了激活的JNK信號(hào)途徑在Myostatin負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和