DAG-PKC信號轉導途徑調(diào)控機制的初步研究.pdf

1、DAG/PKC信號轉導通路在細胞內(nèi)信號調(diào)控網(wǎng)絡中具有重要作用，是參與細胞生長、增殖、分裂調(diào)控的重要信號通路之一，并廣泛分布于各種組織細胞。本研究工作觀察了Ley寡糖及PEMT2過表達對DAG/PKC信號轉導途徑的調(diào)控作用。 Ley寡糖對DAG/PKC信號轉導途徑的調(diào)控作用的研究哺乳動物胚胎著床是生殖的關鍵環(huán)節(jié)，涉及胚胎與子宮之間所發(fā)生的同步協(xié)調(diào)的一系列變化。 核酸和蛋白質的合成均需模板來決定其核苷酸或氨基酸的排列順序

2、，而糖鏈的合成卻沒有模板，它是由一系列具有高度特異性的糖基轉移酶的催化作用來完成。巖藻糖化寡糖的合成是由巖藻糖基轉移酶(fucosyltranferases，F(xiàn)UTs)催化的。因此，巖藻糖基轉移酶的表達可能是這些巖藻糖基化寡糖抗原合成及其表達調(diào)控的關鍵。目前發(fā)現(xiàn)11種巖藻糖基轉移酶，小鼠主要表達FUT1，2，4,7，8，9共6種功能性巖藻糖基轉移酶，其余為假基因。其中FUT1和FUT4參與Ley寡糖的合成，F(xiàn)UT7參與sLex寡糖的合成

3、，而FUT9是Lex寡糖合成所必需的。本室前期的研究工作觀察了部分FUTs在著床過程中的表達及調(diào)控，但FUTs家族在小鼠胚胎著床過程中的表達譜變化尚不清楚。 進一步探討Ley寡糖的作用機制，采用共價連接Ley寡糖的瓊脂糖小球模擬胚胎與人子宮內(nèi)膜上皮細胞共孵育，觀察了Ley寡糖對子宮內(nèi)膜細胞DAG/PKC信號轉導途徑的影響。 根據(jù)以上實驗結果推測人子宮內(nèi)膜細胞(JEC細胞)膜蛋白中存在Ley寡糖的特異性結合蛋白或稱之為L

4、ey寡糖受體。Ley寡糖通過與此受體結合啟動細胞內(nèi)特定的信號轉導通路以促進胚胎著床。為尋找此蛋白，分別采用親和層析及親和吸附沉淀技術對JEC細胞膜蛋白中的Ley寡糖特異性結合蛋白進行分離純化，并采用SDS-PAGE和Westernblot技術對其進行初步鑒定。 PEMT2過表達對DAG/PKC信號轉導途徑的調(diào)控作用的研究磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶2的作用是催化磷脂酰乙醇胺甲基化生成磷脂酰膽堿。該酶在肝外組織活性極低，主要分布于

5、正常肝組織。一般認為，肝細胞合成PC的主要途徑是CDP—膽堿途徑，PE甲基化途徑只是作為CDP-膽堿途徑的補充。但研究發(fā)現(xiàn)，pemt2基因的表達與肝細胞的增殖分裂呈負相關。增殖快的細胞如肝癌細胞、再生肝組織中PEMT2表達量很低，而正常肝細胞中PEMT2的表達活性較高。轉染pemt2-cDNA可抑制肝癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。因此，一些作者把PEMT2看作是肝細胞特異的抑癌蛋白。在前期工作中，我們將pemt2-cDNA插入含有neo抗性

6、基因的pLNCX表達質粒中，構建了pLNCX-pemt2重組質粒并將其轉染入大鼠肝癌CBRH-7919細胞，發(fā)現(xiàn)PEMT2過表達抑制大鼠肝癌CBRH-7919細胞增殖并誘導細胞凋亡。但其機制不明。已知，細胞的生長、增殖、分裂和癌變是受細胞內(nèi)信號調(diào)控網(wǎng)絡精確調(diào)控的，為探討PEMT2過表達抑制大鼠肝癌CBRH-7919細胞增殖的機制，我們重點研究了轉染pemt2基因對大鼠肝癌CBRH-7919細胞二脂酰甘油(DAG)/蛋白激酶C(PKC)信

7、號轉導途徑的影響，從而揭示PEMT2過表達抑制肝癌細胞增殖、誘導凋亡的分子機制. DAG/PKC信號轉導途經(jīng)是細胞內(nèi)參與細胞的生長增殖、分化、腫瘤的發(fā)生及逆轉、細胞凋亡及代謝調(diào)控的重要信號轉導途徑之一。PKC是這條信號轉導通路中的關鍵分子。PKC有多種亞型，不同的PKC亞型其功能、在組織中分布不同，其活性調(diào)節(jié)機制也不同。肝細胞中主要表達cPKCα、cPKCβ和nPKCε等亞型。采用免疫細胞化學和Westernblot技術，我們

8、觀察了轉染pemt2對CBRH-7919細胞不同亞型PKC表達和轉位的影響。結果發(fā)現(xiàn)，轉染pemt2可顯著抑制cPKCα的表達，促進cPKCβ2的表達，同時促進cPKCβ2由胞漿向胞膜移位。而轉染pemt2對cPKCβ1和nPKCε的表達無顯著影響。 總之，轉染pemt2基因可抑制cMet的表達和激活，其結果使PLCγ1磷酸化活化受到抑制，細胞內(nèi)DAG生成減少，從而使PKCα活性降低，這可能是PEMT2過表達抑制肝癌細胞生長增