家蠶速激肽受體A32信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究.pdf

1、速激肽受體(TKR)是一類典型的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor),介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,TKR的缺失會導(dǎo)致正常代謝受到干擾,因此速激肽及其受體系統(tǒng)研究是研究人類代謝的一個很好的模型。研究表明速激肽在人體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能,家蠶作為人類經(jīng)典模式生物對其速激肽受體A32的研究具有重大意義。因此,我們對家蠶速激肽受體A32信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們克隆得到的A32受體在995～1010b

2、p有16個堿基的缺失,為了確定這個新的發(fā)現(xiàn),我們從27個家蠶品種的5齡幼蟲脂肪體中提取RNA,利用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄cDNA的方法發(fā)現(xiàn)只4個品種是野生型,其余23個品種均是突變型。為了分析野生型跟突變型生理功能差異,我們構(gòu)建了EGFP-A32的表達載體,將插入野生型和突變型A32片段的兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)野生型受體A32大部分分布在細(xì)胞膜上,也有少量分布在胞內(nèi),但突變型受體A32沒有分布在細(xì)胞膜上,

3、而是分布在細(xì)胞質(zhì)中。在家蠶速激肽的作用下,野生型受體A32分布位置發(fā)生改變,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核周圍,呈點狀聚集分布,其中TK4、TK5、TK6的作用尤為明顯,而突變型受體A32的分布沒有明顯變化。
　　所有的G蛋白偶聯(lián)受體都能夠促進MAPK的信號級聯(lián)反應(yīng),參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡,最終影響生物的生長、發(fā)育、生殖以及代謝等。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP激酶,MAPK)鏈

4、是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一,其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracelluar regulated protern,ERK)是MAPK家族重要成員。ERK1/2信號途徑對細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞凋亡起重要調(diào)控作用。我們的實驗結(jié)果表明,受體A32受到配體TK4、TK5、TK6刺激后,會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬時增加和cAMP濃度增加,隨后MAPK被激活。為了弄清其激活途徑我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達A32受體的HEK293細(xì)胞株,結(jié)果發(fā)

5、現(xiàn)細(xì)胞用百日咳毒素預(yù)處理后對cAMP沒有明顯反應(yīng),但是用霍亂毒素處理細(xì)胞過夜再用家蠶速激肽刺激,cAMP的水平仍有明顯提高。以上結(jié)果說明在HEK293細(xì)胞中,受體A32介導(dǎo)的信號通路是通過偶聯(lián)Gs蛋白激活下游信號進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。第三章我們研究ERK1/2介導(dǎo)的磷酸化,通過用用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A32受體的HEK293細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)在TK4、TK5、TK6刺激下,BNGR-A32激活后能引起ERK1/2磷酸化瞬時增加,而家蠶脂動激素AKH1,Coraz