煙酸受體GPR109A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)吞分子機(jī)制研究.pdf

1、煙酸作為一種降脂藥物已經(jīng)在臨床上廣泛使用了50多年，煙酸不僅能夠有效降低LDL-C的同時(shí)，還能提高HDL-C的水平，而煙酸受體GPR109A的發(fā)現(xiàn)為治療高血脂和心血管系統(tǒng)疾病提供了一個(gè)很好的分子靶標(biāo)，GPR109A受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究和小分子激動(dòng)劑藥物的研發(fā)因而受到廣泛的重視。然而GPR109A受體內(nèi)吞和其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的詳細(xì)機(jī)制還不清楚。
　　 研究表明GPR109A受體的內(nèi)吞主要由GRK2和arrestin3調(diào)節(jié)，而Gβγ

2、起到了招募GRK2到細(xì)胞膜上的作用。蔗糖預(yù)處理或siRNA干擾網(wǎng)格蛋白的表達(dá)，GPR109A受體的內(nèi)吞均受到顯著抑制，說(shuō)明其內(nèi)吞是網(wǎng)格蛋白小泡依賴(lài)性的。進(jìn)一步研究表明，當(dāng)配體去除后，GPR109A能迅速回到細(xì)胞膜上，而且內(nèi)含體的酸化對(duì)這一過(guò)程并不是必需的。百日咳毒素預(yù)處理不僅能抑制煙酸對(duì)forskolin引起的胞內(nèi)cAMP含量升高的抑制，還能抑制煙酸介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣流以及GPR109A受體的內(nèi)吞。
　　 通過(guò)缺失和定點(diǎn)突變，我們發(fā)現(xiàn)

3、GPR109A羧基端在調(diào)控受體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，以及受體內(nèi)吞、失敏及其自身活化方面扮演非常重要的角色?！?95-314突變體完全不能定位到細(xì)胞膜上而位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而且不會(huì)介導(dǎo)激動(dòng)劑引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?！?15-328突變體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與野生型(WT)的受體相似，但其內(nèi)吞和失敏卻受到顯著的影響。通過(guò)逐步定點(diǎn)突變，我們發(fā)現(xiàn)絲氨酸和蘇氨酸簇(326STS328)在受體的內(nèi)吞、失敏以及arrestin3轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上起到關(guān)鍵的調(diào)控作用?！?

4、29-343突變體與野生型GPR109A相似，配體刺激后會(huì)快速發(fā)生內(nèi)吞，然而出乎意料的是，該突變交體還能通過(guò)配體非依賴(lài)性的途徑發(fā)生內(nèi)吞。
　　 幾乎所有的GPCR都會(huì)通過(guò)MAPK傳遞信號(hào)，MAPK是重要的細(xì)胞調(diào)控因子，調(diào)控許多重要的生理過(guò)程如細(xì)胞的生殖、生長(zhǎng)、分化、凋亡等。利用細(xì)胞外源性表達(dá)GPR109A的CHO-K1以及內(nèi)源性表達(dá)GPR109A的A431細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)GPR109A能介導(dǎo)ERK1/2快速的，PTX敏感的磷酸化。

5、通過(guò)時(shí)間梯度研究，我們發(fā)現(xiàn)PKC激酶主要調(diào)控GPR109A介導(dǎo)的早期ERK1/2的活化，而EGFR轉(zhuǎn)激活則參與整個(gè)GPR109A介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化。通過(guò)過(guò)量表達(dá)Gβγ拮抗劑βARK1-CT andα-transducin，我們發(fā)現(xiàn)Gβγ在調(diào)控GPR109A介導(dǎo)的ERK1/2活化過(guò)程中起到非常重要的調(diào)控作用。另外，利用arrestin-2/3 SiRNA特異性沉默穩(wěn)定表達(dá)GPR109A的HEK293細(xì)胞內(nèi)arrestin-2/3蛋白

6、，我們發(fā)現(xiàn)arrestin-2/3并不參與調(diào)控GPR109A介導(dǎo)的ERK1/2的活化。
　　 通過(guò)上述研究，我們闡明了人煙酸受體GPR109A受體內(nèi)吞的詳細(xì)機(jī)制，其羧基端對(duì)受體定位、內(nèi)吞、失敏、arrestin3結(jié)合以及自身活化的調(diào)控，以及其調(diào)控ERK1/2磷酸化的途徑。在此基礎(chǔ)之上，我們希望通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明GPR109A介導(dǎo)的降低血脂和引起皮膚潮紅的詳細(xì)機(jī)理，為開(kāi)發(fā)更加高效而同時(shí)不會(huì)引起皮膚潮紅的降血脂藥物提供理論基礎(chǔ)。