毒蕈堿型乙酰膽堿受體M2和M4的內(nèi)吞及內(nèi)吞后轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制研究.pdf

1、G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的內(nèi)吞和內(nèi)吞后的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于細(xì)胞表面受體含量及信號(hào)的控制是十分重要的。在激動(dòng)劑刺激條件下，大多數(shù)的GPCR通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞（CDE）途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它們被募集到網(wǎng)格蛋白包被小泡（CCP）中，CCP成熟后形成網(wǎng)格蛋白包被囊泡（CCV）并運(yùn)送GPCR分子進(jìn)入到早期內(nèi)涵體（EEs）中，在此被分選進(jìn)入降解或者回收的途徑。然而，有些 GPCR可以通過(guò)非網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞（CIE）途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。CIE內(nèi)吞途徑包括

2、依賴驅(qū)動(dòng)蛋白（dynamin）的小窩（caveolae）和一些不依賴dynamin的途徑。與CDE途徑的機(jī)制不同，調(diào)控GPCR信號(hào)的CIE途徑機(jī)制仍然存在許多空白。
　　毒蕈堿型乙酰膽堿受體（mAChRs）屬于A家族GPCR。其中結(jié)構(gòu)和功能都類似的兩種亞型M2和M4，它們的內(nèi)吞途徑和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制都不相同：M4經(jīng)由CDE途徑進(jìn)入到循含內(nèi)涵體中（REs）并循環(huán)上膜；而M2經(jīng)由CIE途徑進(jìn)入到溶酶體（lysosomes）中并被降解。本文

3、中通過(guò)比較 M2和 M4的第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)狀區(qū)域（i3 loop）的序列差異，在HKE293細(xì)胞中研究M2和M4的內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，取得了如下結(jié)果：
　?。?）發(fā)現(xiàn)了CIE途徑內(nèi)吞也可以是序列依賴的過(guò)程。mAChRs含有較短的C-尾部，但具有特別長(zhǎng)的第三段胞內(nèi)環(huán)（i3 loop）。I3 loop中含有mAChRs的G-蛋白結(jié)合位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)于受體的內(nèi)吞和內(nèi)吞后轉(zhuǎn)運(yùn)是至關(guān)重要的。據(jù)報(bào)道，V373-A393序列的切除能夠阻止M4的

4、內(nèi)吞，而將含有21個(gè)氨基酸的該段序列進(jìn)一步縮短，發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)氨基酸的序列R396-A393足以決定M4的內(nèi)吞。同時(shí)，在M2受體中，切除了與V373-A393同一位置的20個(gè)氨基酸序列V361-S380，發(fā)現(xiàn)M2不能內(nèi)吞?；诖私Y(jié)果，第一次發(fā)現(xiàn)了決定M2的CIE途徑的短序列374KKKPPPS380。將374KKKPPPS380置換M4的對(duì)應(yīng)序列，發(fā)現(xiàn)M4的內(nèi)吞由 CDE轉(zhuǎn)變?yōu)?CIE模式。同時(shí)鑒定了在此序列上游的序列361VARKIVK

5、MTKQPA373能夠引導(dǎo) M2進(jìn)入 CDE模式，但是該內(nèi)吞途徑被374KKKPPPS380所屏蔽。
　?。?）發(fā)現(xiàn)的決定CIE內(nèi)吞方式的序列可能參與了mAChR的溶酶體定位和降解。據(jù)報(bào)道，V373-A393對(duì)于M4的循環(huán)上膜是必須的?；谝陨系陌l(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證374KKKPPPS380是否影響M2的降解。M2受體切除掉序列374KKKPPPS380導(dǎo)致內(nèi)吞方式由CIE轉(zhuǎn)變?yōu)镃DE，但是并不能影響M2被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體的命運(yùn)。在激

6、動(dòng)劑刺激下，該缺失突變體顯示出與溶酶體標(biāo)記分子 LAMP-1明顯的共定位，而并不與循環(huán)內(nèi)涵體標(biāo)記分子Rab11共定位。而且，將374KKKPPPS380置換M4的對(duì)應(yīng)序列，發(fā)現(xiàn)M4也會(huì)定位于LAMP-1標(biāo)記的溶酶體中。綜合上述，揭示了GPCR的內(nèi)吞和降解都是可能依賴自身序列的。
　　(3)發(fā)現(xiàn)了內(nèi)吞方式的改變對(duì)mAChR的活性可能沒(méi)有影響。在激動(dòng)劑的刺激下，ERK1/2在表達(dá)有mAChR的細(xì)胞中會(huì)被磷酸化。在研究中，系統(tǒng)地考察了激