昆蟲(chóng)煙堿型乙酰膽堿受體的殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)亞基鑒定.pdf

1、煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)是昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)受體，同時(shí)也是煙堿類、新煙堿類、多殺菌素類和沙蠶毒素類等殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)。但煙堿型乙酰膽堿受體的組成和殺蟲(chóng)劑對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)亞基還不清楚，不能針對(duì)性的研究殺蟲(chóng)劑的選擇性和害蟲(chóng)抗藥性檢測(cè)。
　　對(duì)煙堿型乙酰膽堿受體的研究有許多方法，如基因分子克隆、基因外源表達(dá)、免疫共沉淀等。通過(guò)外源表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行受體亞基

2、的表達(dá)，從而對(duì)受體亞基的組合以及亞基功能區(qū)域的定位和藥理學(xué)特性進(jìn)行研究是一種體外研究乙酰膽堿受體的重要方法。目前在外源表達(dá)系統(tǒng)中只能采取昆蟲(chóng)-脊椎動(dòng)物雜合nAChRs的表達(dá)研究，對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)nAChRs的天然亞基構(gòu)成的認(rèn)識(shí)仍有局限，因?yàn)檫@些體外雜合表達(dá)的受體并不代表體內(nèi)真正的存在形式，也并不是任何時(shí)候體外表達(dá)的功能受體的電流反應(yīng)都能準(zhǔn)確反應(yīng)殺蟲(chóng)劑的作用情況，這與構(gòu)建的雜合受體本身密切相關(guān)。此外免疫共沉淀是用來(lái)研究蛋白質(zhì)相互作用的傳統(tǒng)方式。

3、本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)褐飛虱內(nèi)源nAChRs進(jìn)行免疫共沉淀分析，對(duì)內(nèi)源nAChRs的共聚方式有了一定進(jìn)展，但是該方法也有不足之處，比如需要制備特異抗體，需要大量的測(cè)試樣本等，操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。因此這促使我們尋找新的方法并結(jié)合傳統(tǒng)的技術(shù)來(lái)研究昆蟲(chóng)nAChRs的殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)亞基鑒定。
　　為了分析殺蟲(chóng)劑的靶標(biāo)亞基，本文選取了褐飛虱和美洲大蠊兩種昆蟲(chóng)作為材料。褐飛虱是重要水稻害蟲(chóng)，本實(shí)驗(yàn)室前期已開(kāi)展大量體外研究，本文通過(guò)免疫共沉淀和結(jié)合消除的

4、方式分析褐飛虱nAChRs亞基與殺蟲(chóng)劑的對(duì)應(yīng)關(guān)系。美洲大蠊是理想的模式昆蟲(chóng)，其DUM神經(jīng)元是研究殺蟲(chóng)劑神經(jīng)靶標(biāo)的理想細(xì)胞模型，因此在美洲大蠊DUM神經(jīng)元細(xì)胞中通過(guò)RNAi和膜片鉗結(jié)合的方式，研究nAChRs亞基與殺蟲(chóng)劑的對(duì)應(yīng)關(guān)系。期望通過(guò)兩種昆蟲(chóng)nAChRs亞基與殺蟲(chóng)劑對(duì)應(yīng)關(guān)系的研究，明確相應(yīng)靶標(biāo)亞基，為建立受體-殺蟲(chóng)劑相互作用模型奠定基礎(chǔ)。
　　本文采用免疫共沉淀和放射性配基結(jié)合技術(shù)、神經(jīng)細(xì)胞RNAi與膜片鉗檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了昆蟲(chóng)神

5、經(jīng)系統(tǒng)中新煙堿類殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉nAChRs靶標(biāo)亞基的研究。利用免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)褐飛虱N1α1、N1α2和N1β1構(gòu)成內(nèi)源受體N1α1/N1α2/N1β1，而N1α3、N1α8和N1β1構(gòu)成內(nèi)源受體N1α3/N1α8/N1β1;利用不同亞基的特異抗體對(duì)褐飛虱頭部膜蛋白中的亞基進(jìn)行逐個(gè)免疫消除，證實(shí)N1α1/N1α2/N1β1構(gòu)成吡蟲(chóng)啉低親和力位點(diǎn)，而N1α3/N1α8/N1β1構(gòu)成吡蟲(chóng)啉高親和力位點(diǎn)，明確N1α1、N1α2、N1α3、N1

6、α8和N1β1均為吡蟲(chóng)啉的靶標(biāo)亞基。采用分子生物學(xué)技術(shù)克隆了美洲大蠊nAChRs的α1、α2、α8、β1亞基全長(zhǎng)序列。采用轉(zhuǎn)染siRNA的方法對(duì)美洲大蠊DUM神經(jīng)元nAChRs的Paα1、Paα2、Paα3、Paα6、Paα8和Paβ1亞基進(jìn)行了RNA干擾研究，干擾后各亞基的表達(dá)量明顯下降，達(dá)到較為理想的干擾效率。采用膜片鉗與RNA干擾結(jié)合的方式，研究干擾Paα1、Paα2、Paα3、Paα6、Paα8和Paβ1后美洲大蠊神經(jīng)細(xì)胞的對(duì)吡

7、蟲(chóng)啉和乙酰膽堿的藥理學(xué)特性，分析各個(gè)亞基與化合物之間的聯(lián)系，證實(shí)其中Paα1、Paα2、Paα3、Paα8和Paβ1亞基是與吡蟲(chóng)啉特異結(jié)合的靶標(biāo)亞基。
　　一、褐飛虱煙堿型乙酰膽堿受體的內(nèi)源亞基組成研究
　　將褐飛虱頭部提取物與Nb1-Ⅰ進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，所獲得的蛋白分別利用Nb1-Ⅰ或N1-Ⅰ，N2-Ⅰ，N3-Ⅰ或者N8-Ⅰ進(jìn)行免疫印跡分析，均檢測(cè)到了單一的條帶，且均能被相應(yīng)的融合蛋白N1β1消除。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)前期關(guān)于N1α

8、1和N1α2免疫共沉淀、N1α3和N1α8免疫共沉淀的結(jié)果，說(shuō)明褐飛虱N1α1、N1α2和N1β1三個(gè)亞基在同一個(gè)內(nèi)源受體中，構(gòu)成內(nèi)源受體N1α1/N1α2/N1β1;而N1α3、N1α8和N1β1在另外一個(gè)內(nèi)源受體中，構(gòu)成內(nèi)源受體N1α3/N1α8/N1β1，同一個(gè)受體中的亞基具有直接的蛋白互作關(guān)系。
　　利用不同亞基的特異抗體對(duì)褐飛虱頭部膜蛋白中的亞基進(jìn)行逐個(gè)免疫消除，能夠在[3H]標(biāo)記的吡蟲(chóng)啉結(jié)合實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生一個(gè)劑量依賴的降低

9、曲線。利用N1α1和N1α2特異性抗體進(jìn)行免疫消除后，[3H]標(biāo)記吡蟲(chóng)啉的結(jié)合效率降低了大約67％(N1-Ⅰ為66.3±7.3％;N2-Ⅰ為67.6±5.9％)，同時(shí)低親和力位點(diǎn)消失。利用N1α3和N1α8特異性抗體進(jìn)行免疫消除后，[3H]標(biāo)記的吡蟲(chóng)啉的結(jié)合效率降低了大約33％（N3-Ⅰ為32.5±4.1％;N8-Ⅰ為33.3±3.6％），同時(shí)高親和力位點(diǎn)消失。當(dāng)利用特異性抗體Nb1-Ⅰ對(duì)N1β1亞基進(jìn)行免疫消除后，可以完全消除[3H]

10、標(biāo)記的吡蟲(chóng)啉的結(jié)合位點(diǎn);利用其他亞基N1α4、N1α6、N1α7或N1b2的特異性抗體（N4-Ⅰ、N6-Ⅰ、N7-Ⅰ或Nb2-Ⅰ）進(jìn)行消除后，對(duì)[3H]標(biāo)記的吡蟲(chóng)啉的結(jié)合效率并沒(méi)有明顯的影響。這些結(jié)果說(shuō)明N1α1/N1α2/N1β1構(gòu)成吡蟲(chóng)啉低親和力位點(diǎn)（Kd=1.5±0.2nM），而N1α3/N1α8/N1β1構(gòu)成吡蟲(chóng)啉高親和力位點(diǎn)（Kd=3.5±0.6pM）。同時(shí)結(jié)果表明，N1α1、N1α2、N1α3、N1α8和N1β1均為吡蟲(chóng)啉的

11、靶標(biāo)亞基。
　　二、美洲大蠊煙堿型乙酰膽堿受體α1、α2、α8、β1亞基基因的克隆
　　煙堿型乙酰膽堿受體的基因克隆是研究其性質(zhì)和組成的重要組成部分，能夠?yàn)橐院蟮拿庖叱恋?、體外表達(dá)、RNA干擾等實(shí)驗(yàn)提供良好的基礎(chǔ)。目前美洲大蠊nAChRs的基因序列并不完整，已克隆得到的只有α3、α4、α6、α7，因此本章利用其他昆蟲(chóng)nAChRs亞基序列的同源性比對(duì)，首先設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，PCR克隆出了部分片段，然后結(jié)合RACE技術(shù)，克隆出美洲

12、大蠊nAChRs的α1、α2、α8、β1亞基的基因全長(zhǎng)。Paα1基因全長(zhǎng)2536bp，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?662bp，編碼554個(gè)氨基酸，GeneBank登錄號(hào)為:JF784150.1。Paα2基因全長(zhǎng)2691bp，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?055bp，編碼685個(gè)氨基酸，GeneBank登錄號(hào)為:JF784151.1。Paα8基因全長(zhǎng)3011bp，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?767bp，編碼589個(gè)氨基酸，GeneBank登錄號(hào)為JF784153.1。Paβ1

13、基因全長(zhǎng)2379bp，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?632bp，編碼544個(gè)氨基酸，GeneBank登錄號(hào)為:JF784154.1。4個(gè)亞基基因結(jié)構(gòu)特征分析也顯示，它們均具有nAChRs亞基的典型特征，如α亞基均具有典型的雙半胱氨酸結(jié)構(gòu)、4個(gè)跨膜片段，氨基酸殘基形成的環(huán)（α亞基有LoopA-C環(huán)，β亞基有LoopD-F環(huán)）及兩個(gè)糖基化位點(diǎn)等。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)和同源性分析，從美洲大蠊中克隆的α1、α2、α8、β1亞基與已報(bào)道的昆蟲(chóng)nAChRs相應(yīng)亞基具有很

14、高的同源性。這說(shuō)明本研究克隆的4個(gè)亞基均為美洲大蠊的nAChRs亞基基因。結(jié)合同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，分別將克隆出的美洲大蠊nAChR亞基命名為Paα1、Paα2、Paα8、Paβ1。
　　三、美洲大蠊神經(jīng)細(xì)胞的RNA干擾研究
　　RNA干擾是一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過(guò)阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制基因表達(dá)。在昆蟲(chóng)領(lǐng)域，RNAi技術(shù)主要用于研究昆蟲(chóng)功能基因和功能基因組等方面，并已在包括鞘翅

15、目、半翅目、直翅目、蜚蠊目等19種昆蟲(chóng)中取得成功。但是目前RNA干擾廣泛利用的注射法和飼喂法存在一些不足之處，比如干擾效率不高，容易對(duì)蟲(chóng)體產(chǎn)生損傷等，這促使我們尋找效果更好的方法。美洲大蠊的DUM神經(jīng)元易于分離培養(yǎng)，目前已證實(shí)其細(xì)胞膜上表達(dá)鉀離子通道、電壓依賴的鈉離子通道、鈣離子通道、氯離子通道、乙酰膽堿受體、谷氨酸受體等多種離子通道和受體，是研究殺蟲(chóng)劑神經(jīng)毒性和昆蟲(chóng)抗性的理想細(xì)胞模型。
　　本章根據(jù)Paα1、Paα2、Paα3、

16、Paα6、Paα8和Paβ1的基因序列設(shè)計(jì)合成了相應(yīng)的特異siRNA，將其轉(zhuǎn)染入神經(jīng)細(xì)胞后，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)其在12小時(shí)和24小時(shí)后的干擾效率。定量結(jié)果得出，這6個(gè)亞基在12小時(shí)和24小時(shí)表達(dá)量均有下調(diào)。其在12小時(shí)的對(duì)應(yīng)的干擾效率分別是36.1％、24.3％、18.7％、28.9％、31.4％和25.3％，;在24小時(shí)的對(duì)應(yīng)的干擾效率分別為62.4％、49.6％、42.8％、64.5％、68.3％和55.4％。通過(guò)分析我們發(fā)現(xiàn)，

17、各亞基的mRNA的表達(dá)量在12小時(shí)已經(jīng)有所降低，但并不足以用于分析研究，在24小時(shí)后能夠達(dá)到較低的表達(dá)水平。其中，Paβ1和Paα8是干擾24小時(shí)后表達(dá)量最低的兩個(gè)亞基，只有對(duì)照表達(dá)量的三分之一左右?？偟膩?lái)說(shuō)24小時(shí)干擾后，各亞基均能達(dá)到較為理想的干擾效率，可以用來(lái)進(jìn)行后續(xù)的進(jìn)一步研究。綜上所述通過(guò)此體系可以有效的干擾美洲大蠊nAChRs各個(gè)亞基的表達(dá)水平。此套R(shí)NA干擾方法的建立，有利于今后使用siRNA對(duì)美洲大蠊DUM神經(jīng)元中各種基

18、因的表達(dá)進(jìn)行干擾，來(lái)研究各個(gè)基因的功能。在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中還可以采取與電生理技術(shù)結(jié)合的方式，來(lái)研究美洲大蠊nAChRs亞基組成及其藥理學(xué)特性，有利于明確鑒定殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)亞基，為以后闡明各個(gè)nAChRs基因的功能提供了一個(gè)新的角度，從而為新農(nóng)藥選擇性的開(kāi)發(fā)和抗藥性亞基檢測(cè)提供理論依據(jù)。
　　四、美洲大蠊神經(jīng)細(xì)胞RNA干擾后的電生理研究
　　本章利用RNAi技術(shù)干擾了美洲大蠊DUM神經(jīng)元nAChRs的Paα1、Paα2、Paα3、P

19、aα6、Paα8和Paβ1亞基的表達(dá)，結(jié)合膜片鉗技術(shù)記錄神經(jīng)元的干擾組和對(duì)照組上吡蟲(chóng)啉和乙酰膽堿的誘導(dǎo)電流，并計(jì)算其EC50和Imax值。研究結(jié)果證實(shí)，吡蟲(chóng)啉在作用于分別干擾Paα1、Paα2、Paα3和Paα8亞基的神經(jīng)元時(shí)，EC50有顯著變化，這證實(shí)了Paα1、Paα2、Paα3和Paα8亞基是nAChR中吡蟲(chóng)啉特異結(jié)合的靶標(biāo)亞基;干擾Paβ1亞基后，對(duì)吡蟲(chóng)啉和乙酰膽堿的Imax有顯著性影響，說(shuō)明Paβ1是nAChR中形成功能受體重