昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體的殺蟲劑靶標亞基鑒定.pdf

1、煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)是昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)受體，同時也是煙堿類、新煙堿類、多殺菌素類和沙蠶毒素類等殺蟲劑的作用靶標。但煙堿型乙酰膽堿受體的組成和殺蟲劑對應(yīng)的靶標亞基還不清楚，不能針對性的研究殺蟲劑的選擇性和害蟲抗藥性檢測。
　　對煙堿型乙酰膽堿受體的研究有許多方法，如基因分子克隆、基因外源表達、免疫共沉淀等。通過外源表達系統(tǒng)進行受體亞基

2、的表達，從而對受體亞基的組合以及亞基功能區(qū)域的定位和藥理學(xué)特性進行研究是一種體外研究乙酰膽堿受體的重要方法。目前在外源表達系統(tǒng)中只能采取昆蟲-脊椎動物雜合nAChRs的表達研究，對昆蟲體內(nèi)nAChRs的天然亞基構(gòu)成的認識仍有局限，因為這些體外雜合表達的受體并不代表體內(nèi)真正的存在形式，也并不是任何時候體外表達的功能受體的電流反應(yīng)都能準確反應(yīng)殺蟲劑的作用情況，這與構(gòu)建的雜合受體本身密切相關(guān)。此外免疫共沉淀是用來研究蛋白質(zhì)相互作用的傳統(tǒng)方式。

3、本實驗室前期對褐飛虱內(nèi)源nAChRs進行免疫共沉淀分析，對內(nèi)源nAChRs的共聚方式有了一定進展，但是該方法也有不足之處，比如需要制備特異抗體，需要大量的測試樣本等，操作繁瑣，實驗周期長。因此這促使我們尋找新的方法并結(jié)合傳統(tǒng)的技術(shù)來研究昆蟲nAChRs的殺蟲劑靶標亞基鑒定。
　　為了分析殺蟲劑的靶標亞基，本文選取了褐飛虱和美洲大蠊兩種昆蟲作為材料。褐飛虱是重要水稻害蟲，本實驗室前期已開展大量體外研究，本文通過免疫共沉淀和結(jié)合消除的

4、方式分析褐飛虱nAChRs亞基與殺蟲劑的對應(yīng)關(guān)系。美洲大蠊是理想的模式昆蟲，其DUM神經(jīng)元是研究殺蟲劑神經(jīng)靶標的理想細胞模型，因此在美洲大蠊DUM神經(jīng)元細胞中通過RNAi和膜片鉗結(jié)合的方式，研究nAChRs亞基與殺蟲劑的對應(yīng)關(guān)系。期望通過兩種昆蟲nAChRs亞基與殺蟲劑對應(yīng)關(guān)系的研究，明確相應(yīng)靶標亞基，為建立受體-殺蟲劑相互作用模型奠定基礎(chǔ)。
　　本文采用免疫共沉淀和放射性配基結(jié)合技術(shù)、神經(jīng)細胞RNAi與膜片鉗檢測技術(shù)進行了昆蟲神

5、經(jīng)系統(tǒng)中新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉nAChRs靶標亞基的研究。利用免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)褐飛虱N1α1、N1α2和N1β1構(gòu)成內(nèi)源受體N1α1/N1α2/N1β1，而N1α3、N1α8和N1β1構(gòu)成內(nèi)源受體N1α3/N1α8/N1β1;利用不同亞基的特異抗體對褐飛虱頭部膜蛋白中的亞基進行逐個免疫消除，證實N1α1/N1α2/N1β1構(gòu)成吡蟲啉低親和力位點，而N1α3/N1α8/N1β1構(gòu)成吡蟲啉高親和力位點，明確N1α1、N1α2、N1α3、N1

6、α8和N1β1均為吡蟲啉的靶標亞基。采用分子生物學(xué)技術(shù)克隆了美洲大蠊nAChRs的α1、α2、α8、β1亞基全長序列。采用轉(zhuǎn)染siRNA的方法對美洲大蠊DUM神經(jīng)元nAChRs的Paα1、Paα2、Paα3、Paα6、Paα8和Paβ1亞基進行了RNA干擾研究，干擾后各亞基的表達量明顯下降，達到較為理想的干擾效率。采用膜片鉗與RNA干擾結(jié)合的方式，研究干擾Paα1、Paα2、Paα3、Paα6、Paα8和Paβ1后美洲大蠊神經(jīng)細胞的對吡

7、蟲啉和乙酰膽堿的藥理學(xué)特性，分析各個亞基與化合物之間的聯(lián)系，證實其中Paα1、Paα2、Paα3、Paα8和Paβ1亞基是與吡蟲啉特異結(jié)合的靶標亞基。
　　一、褐飛虱煙堿型乙酰膽堿受體的內(nèi)源亞基組成研究
　　將褐飛虱頭部提取物與Nb1-Ⅰ進行免疫沉淀反應(yīng)，所獲得的蛋白分別利用Nb1-Ⅰ或N1-Ⅰ，N2-Ⅰ，N3-Ⅰ或者N8-Ⅰ進行免疫印跡分析，均檢測到了單一的條帶，且均能被相應(yīng)的融合蛋白N1β1消除。結(jié)合本實驗前期關(guān)于N1α

8、1和N1α2免疫共沉淀、N1α3和N1α8免疫共沉淀的結(jié)果，說明褐飛虱N1α1、N1α2和N1β1三個亞基在同一個內(nèi)源受體中，構(gòu)成內(nèi)源受體N1α1/N1α2/N1β1;而N1α3、N1α8和N1β1在另外一個內(nèi)源受體中，構(gòu)成內(nèi)源受體N1α3/N1α8/N1β1，同一個受體中的亞基具有直接的蛋白互作關(guān)系。
　　利用不同亞基的特異抗體對褐飛虱頭部膜蛋白中的亞基進行逐個免疫消除，能夠在[3H]標記的吡蟲啉結(jié)合實驗中產(chǎn)生一個劑量依賴的降低

9、曲線。利用N1α1和N1α2特異性抗體進行免疫消除后，[3H]標記吡蟲啉的結(jié)合效率降低了大約67％(N1-Ⅰ為66.3±7.3％;N2-Ⅰ為67.6±5.9％)，同時低親和力位點消失。利用N1α3和N1α8特異性抗體進行免疫消除后，[3H]標記的吡蟲啉的結(jié)合效率降低了大約33％（N3-Ⅰ為32.5±4.1％;N8-Ⅰ為33.3±3.6％），同時高親和力位點消失。當利用特異性抗體Nb1-Ⅰ對N1β1亞基進行免疫消除后，可以完全消除[3H]

10、標記的吡蟲啉的結(jié)合位點;利用其他亞基N1α4、N1α6、N1α7或N1b2的特異性抗體（N4-Ⅰ、N6-Ⅰ、N7-Ⅰ或Nb2-Ⅰ）進行消除后，對[3H]標記的吡蟲啉的結(jié)合效率并沒有明顯的影響。這些結(jié)果說明N1α1/N1α2/N1β1構(gòu)成吡蟲啉低親和力位點（Kd=1.5±0.2nM），而N1α3/N1α8/N1β1構(gòu)成吡蟲啉高親和力位點（Kd=3.5±0.6pM）。同時結(jié)果表明，N1α1、N1α2、N1α3、N1α8和N1β1均為吡蟲啉的

11、靶標亞基。
　　二、美洲大蠊煙堿型乙酰膽堿受體α1、α2、α8、β1亞基基因的克隆
　　煙堿型乙酰膽堿受體的基因克隆是研究其性質(zhì)和組成的重要組成部分，能夠為以后的免疫沉淀、體外表達、RNA干擾等實驗提供良好的基礎(chǔ)。目前美洲大蠊nAChRs的基因序列并不完整，已克隆得到的只有α3、α4、α6、α7，因此本章利用其他昆蟲nAChRs亞基序列的同源性比對，首先設(shè)計了簡并引物，PCR克隆出了部分片段，然后結(jié)合RACE技術(shù)，克隆出美洲

12、大蠊nAChRs的α1、α2、α8、β1亞基的基因全長。Paα1基因全長2536bp，其開放閱讀框為1662bp，編碼554個氨基酸，GeneBank登錄號為:JF784150.1。Paα2基因全長2691bp，其開放閱讀框為2055bp，編碼685個氨基酸，GeneBank登錄號為:JF784151.1。Paα8基因全長3011bp，其開放閱讀框為1767bp，編碼589個氨基酸，GeneBank登錄號為JF784153.1。Paβ1

13、基因全長2379bp，其開放閱讀框為1632bp，編碼544個氨基酸，GeneBank登錄號為:JF784154.1。4個亞基基因結(jié)構(gòu)特征分析也顯示，它們均具有nAChRs亞基的典型特征，如α亞基均具有典型的雙半胱氨酸結(jié)構(gòu)、4個跨膜片段，氨基酸殘基形成的環(huán)（α亞基有LoopA-C環(huán)，β亞基有LoopD-F環(huán)）及兩個糖基化位點等。經(jīng)過序列比對和同源性分析，從美洲大蠊中克隆的α1、α2、α8、β1亞基與已報道的昆蟲nAChRs相應(yīng)亞基具有很

14、高的同源性。這說明本研究克隆的4個亞基均為美洲大蠊的nAChRs亞基基因。結(jié)合同源性比對和系統(tǒng)進化關(guān)系，分別將克隆出的美洲大蠊nAChR亞基命名為Paα1、Paα2、Paα8、Paβ1。
　　三、美洲大蠊神經(jīng)細胞的RNA干擾研究
　　RNA干擾是一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達。在昆蟲領(lǐng)域，RNAi技術(shù)主要用于研究昆蟲功能基因和功能基因組等方面，并已在包括鞘翅

15、目、半翅目、直翅目、蜚蠊目等19種昆蟲中取得成功。但是目前RNA干擾廣泛利用的注射法和飼喂法存在一些不足之處，比如干擾效率不高，容易對蟲體產(chǎn)生損傷等，這促使我們尋找效果更好的方法。美洲大蠊的DUM神經(jīng)元易于分離培養(yǎng)，目前已證實其細胞膜上表達鉀離子通道、電壓依賴的鈉離子通道、鈣離子通道、氯離子通道、乙酰膽堿受體、谷氨酸受體等多種離子通道和受體，是研究殺蟲劑神經(jīng)毒性和昆蟲抗性的理想細胞模型。
　　本章根據(jù)Paα1、Paα2、Paα3、

16、Paα6、Paα8和Paβ1的基因序列設(shè)計合成了相應(yīng)的特異siRNA，將其轉(zhuǎn)染入神經(jīng)細胞后，通過熒光定量PCR檢測其在12小時和24小時后的干擾效率。定量結(jié)果得出，這6個亞基在12小時和24小時表達量均有下調(diào)。其在12小時的對應(yīng)的干擾效率分別是36.1％、24.3％、18.7％、28.9％、31.4％和25.3％，;在24小時的對應(yīng)的干擾效率分別為62.4％、49.6％、42.8％、64.5％、68.3％和55.4％。通過分析我們發(fā)現(xiàn)，

17、各亞基的mRNA的表達量在12小時已經(jīng)有所降低，但并不足以用于分析研究，在24小時后能夠達到較低的表達水平。其中，Paβ1和Paα8是干擾24小時后表達量最低的兩個亞基，只有對照表達量的三分之一左右?？偟膩碚f24小時干擾后，各亞基均能達到較為理想的干擾效率，可以用來進行后續(xù)的進一步研究。綜上所述通過此體系可以有效的干擾美洲大蠊nAChRs各個亞基的表達水平。此套RNA干擾方法的建立，有利于今后使用siRNA對美洲大蠊DUM神經(jīng)元中各種基

18、因的表達進行干擾，來研究各個基因的功能。在接下來的實驗中還可以采取與電生理技術(shù)結(jié)合的方式，來研究美洲大蠊nAChRs亞基組成及其藥理學(xué)特性，有利于明確鑒定殺蟲劑靶標亞基，為以后闡明各個nAChRs基因的功能提供了一個新的角度，從而為新農(nóng)藥選擇性的開發(fā)和抗藥性亞基檢測提供理論依據(jù)。
　　四、美洲大蠊神經(jīng)細胞RNA干擾后的電生理研究
　　本章利用RNAi技術(shù)干擾了美洲大蠊DUM神經(jīng)元nAChRs的Paα1、Paα2、Paα3、P

19、aα6、Paα8和Paβ1亞基的表達，結(jié)合膜片鉗技術(shù)記錄神經(jīng)元的干擾組和對照組上吡蟲啉和乙酰膽堿的誘導(dǎo)電流，并計算其EC50和Imax值。研究結(jié)果證實，吡蟲啉在作用于分別干擾Paα1、Paα2、Paα3和Paα8亞基的神經(jīng)元時，EC50有顯著變化，這證實了Paα1、Paα2、Paα3和Paα8亞基是nAChR中吡蟲啉特異結(jié)合的靶標亞基;干擾Paβ1亞基后，對吡蟲啉和乙酰膽堿的Imax有顯著性影響，說明Paβ1是nAChR中形成功能受體重