α7煙堿型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞損傷與保護(hù)的影響.pdf

1、α7煙堿型乙酰膽堿受體不僅在神經(jīng)細(xì)胞上表達(dá),而且在非神經(jīng)細(xì)胞,例如內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等均有分布表達(dá),參與這些細(xì)胞的功能調(diào)節(jié),并與一些疾病的病理生理變化相關(guān)。將α7煙堿型乙酰膽堿受體作為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的受體激動(dòng)劑已用于多種疾病的治療。研究目的:
　　 流行病學(xué)研究表明吸煙能導(dǎo)致多種心血管疾病,尼古丁作為香煙中主要有毒成分在其中起著重要的作用,但其作用機(jī)制并不十分清楚。同時(shí),尼古丁在阿爾茨海默病中起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和提高

2、認(rèn)知能力的作用。尼古丁作為α7煙堿型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑,可能是通過(guò)激活受體發(fā)揮作用。本研究目的是探討尼古丁通過(guò)直接、間接刺激對(duì)臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子的影響及其作用機(jī)制,然后探討gx-50-一種通過(guò)藥物軟件分析篩選獲得的特異性α7炯?jí)A型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑對(duì)淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響。
　　 研究方法:
　　 首先,采用不同濃度的尼古丁刺激巨噬細(xì)胞(Ana-1),在各時(shí)間點(diǎn)收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清測(cè)定上

3、清中各細(xì)胞因子含量。并選擇6×10-5M,12小時(shí)處理組Ana-1細(xì)胞上清處理臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,收集各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞的上清后檢測(cè)其中的可溶性粘附分子。并用抗TNF-α,抗IL-1β,抗IFN-γ,,抗TNF-α+抗IL-1β的單克隆抗體中和尼古丁處理的巨噬細(xì)胞上清液中相應(yīng)的細(xì)胞因子,再觀察其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)以及對(duì)白細(xì)胞粘附能力的影響。
　　 其次,用不同濃度尼古丁刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞,收集細(xì)胞上清用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)前列腺

4、素E2(PGE2)的表達(dá)。并提取細(xì)胞RNA與蛋白對(duì)環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。然后用βα7煙堿型乙酰膽堿受體拮抗劑銀環(huán)蛇毒素和NF-k抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)預(yù)處理后觀察COX-2和PGE2的表達(dá),并用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)尼古丁與抑制劑處理后NF-kB的轉(zhuǎn)錄水平變化。最后用COX-2抑制劑NS-398預(yù)處理細(xì)胞后觀察尼古丁誘導(dǎo)的細(xì)胞間粘附分子-1蛋白表達(dá)變化。
　　 最后,用不同濃度的gx-50處理大鼠皮質(zhì)

5、神經(jīng)細(xì)胞,MTT法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活性的影響。用MTT和PI/Hoechst33258雙染法觀察gx-50預(yù)處理后對(duì)淀粉樣蛋白誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響,用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法檢測(cè)相關(guān)凋亡基因的表達(dá)。最后用受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)gx-50與α7乙酰膽堿受體的結(jié)合能力。
　　 結(jié)果：
　　 IL-1β在6×10-5M尼古丁處理后12小時(shí)達(dá)高峰,TNF-α在24小時(shí)達(dá)高峰。IL-8和IFN-γ的表達(dá)不受尼古

6、丁的影響。用6×10-5M的尼古丁處理Ana-1細(xì)胞12小時(shí)的上清刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞,能上調(diào)siCAM-1、sVCAM-1和E-selectin的表達(dá)?？筎NF-α,抗IL-1β,抗TNF-α+抗IL-1β單克隆抗體中和Ana-1上清中的向應(yīng)細(xì)胞因子后,內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)sICAM-1和sVCAM-1的量明顯降低,且可以阻斷單個(gè)核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。此外,尼古丁可以濃度依賴性地增加COX-2基因表達(dá)和前列腺素E2的分泌,同時(shí)在乙酰膽堿受體

7、拈抗劑銀環(huán)蛇毒素和NF-kB抑制劑PDTC預(yù)處理后,這種表達(dá)增加明顯得到了抑制。而且用COX-2抑制劑NS-398預(yù)處理后,尼古丁誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)也得到了抑制。
　　 在gx-50實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果顯示1×10-7～1×10-5M的gx-50對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞活性沒(méi)有顯著的影響。在1×10-6的gx-50預(yù)處理后,淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯下降,并且使。Bcl-2/Bax比率顯著上升。另外,gx-50能夠結(jié)合到大鼠皮質(zhì)神經(jīng)

8、細(xì)胞表面的α7炯?jí)A型乙酰膽堿受體。
　　 結(jié)論：
　　 綜上所述,尼古丁作為α7炯?jí)A型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑可以通過(guò)巨噬細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α,IL-1β間接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子ICAM-1和VCAM-1。同時(shí),尼古丁還可以通過(guò)α7乙酰膽堿受體及NF-kB途徑直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎性因子,并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1。此外,gx-50作為一種潛在的α7煙堿型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑能夠有效地抑制Aβ325-35誘導(dǎo)的皮質(zhì)