煙堿型乙酰膽堿受體α7及其特異性激動(dòng)劑在Fmr1基因敲除小鼠學(xué)習(xí)記憶中的作用研究.pdf

1、【目的】探討煙堿型乙酰膽堿受體α7（α7 n）及其特異性激動(dòng)劑在脆性X綜合征模型（Fmr1基因敲除小鼠）學(xué)習(xí)記憶中的作用及可能機(jī)制，為脆性X綜合征的治療提供新靶點(diǎn)。
　　【方法】
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4周齡FVB Fmr1基因敲除（KO）小鼠純合子（-/-）及野生型（WT）純合子（+/+）近交系小鼠。
　　2、利用 PCR法對(duì)4周齡 FVB Fmr1基因敲除（ KO）小鼠和野生型（WT）小鼠進(jìn)行基因型鑒定。
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2、、將實(shí)驗(yàn)小鼠分為：WT空白組和 KO空白組，用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè) KO及 WT小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力；再利用 RT-QPCR、Western Blotting、免疫組織化學(xué)分別檢測(cè)KO及WT小鼠前額皮層及海馬α7 nAChR的表達(dá)。
　　4、將 Fmr1基因敲除小鼠分為5組：生理鹽水組，α7 nAChR特異性激動(dòng)劑氯化膽堿（CC）治療組6mg/kg組，60mg/kg組，100mg/kg組，150mg/kg組；將生理鹽水及氯化膽堿連續(xù)腹腔

3、注射10天，在第8和第9天腹腔注射完藥物60分鐘后用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組的學(xué)習(xí)記憶能力；在第10天腹腔注射完藥物60分鐘后，用 Western Blotting分別檢測(cè)各組小鼠前額皮層和海馬α7 nAChR的表達(dá)。
　　5、數(shù)據(jù)的采集：跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)通過所用的跳臺(tái)儀自動(dòng)顯示出來；基因型PCR鑒定結(jié)果根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)的圖以及出現(xiàn)條帶所對(duì)應(yīng)的Marker大小判斷；RT-QPCR的結(jié)果通過 RT-QPCR儀得出各組樣品和內(nèi)參的 CT值，再利

4、用公式Ratio(test/calibrator)=ECT(calibrator)–CT(test)（假設(shè)反應(yīng)每個(gè)循環(huán)模板量加倍，E為2）算出比值；免疫組織化學(xué)結(jié)果利用Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)出不同部位陽性細(xì)胞表達(dá)的個(gè)數(shù)；Western blotting結(jié)果用 Quantity One圖像分析軟件分析得出同一塊膠內(nèi)目的蛋白與內(nèi)參的比值。
　　6、統(tǒng)計(jì)方法：采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x

5、±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　1、PCR基因鑒定結(jié)果：經(jīng) PCR，WT小鼠擴(kuò)增出約為468bp的 DNA片斷，KO小鼠擴(kuò)增出約為800 bp的DNA片斷，入組的KO小鼠均為Fmr1基因敲除小鼠純合子（-/-），WT小鼠均為野生型純合子（+/+）。
　　2、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1）與

6、 WT空白組比較，KO空白組第一天及第二天的潛伏期均顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2）與生理鹽水組相比，各劑量氯化膽堿（CC）治療組第一天的潛伏期均延長(zhǎng)，但只有100mg/kg CC治療組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3）各劑量CC治療組第二天的潛伏期亦較生理鹽水組延長(zhǎng)，其中60mg/kg、100mg/kg CC治療組差異具有顯著性；60mg/kg、100mg/kg CC治療組第二天的潛伏期較6mg/kg C

7、C治療組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；60mg/kg和100mg/kg CC治療組的潛伏期均較150mg/kg CC治療組顯著延長(zhǎng)，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而60mg/kg CC治療組與100mg/kg CC治療組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4）與生理鹽水組比較，各劑量 CC治療組第一天及第二天的錯(cuò)誤次數(shù)均減少，其中60mg/kg CC治療組、100mg/kg CC治療組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；150mg/kg CC治療組第一天及第二天的錯(cuò)誤次數(shù)均6m

8、g/kg、60mg/kg、100mg/kg CC治療組明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而100mg/kg CC治療組第一天和第二天的錯(cuò)誤次數(shù)均較6mg/kg CC治療組顯著減少，但只有第二天的錯(cuò)誤次數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、RT-QPCR結(jié)果：Fmr1基因敲除小鼠前額皮層α7 nAChR mRNA的表達(dá)量較野生型小鼠減少；Fmr1基因敲除小鼠海馬區(qū)α7 nAChR mRNA的表達(dá)水平亦比野生型小鼠降低。
　　4、免疫組織化學(xué)結(jié)果

9、：與野生型小鼠空白組相比，F(xiàn)mr1 KO小鼠空白組前額皮層和海馬區(qū)α7 nAChR免疫陽性細(xì)胞均顯著減少（291.67±87.37 vs554.86±50.04，270±87.61 vs573.25±41.15），兩者均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、Western Blotting結(jié)果：1）與空白組WT小鼠相比，空白組KO小鼠前額皮層及海馬區(qū)α7 nAChR表達(dá)量均減少，海馬區(qū)更為顯著，兩者均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2）與生理鹽水組比較，不同

10、劑量 CC治療組前額皮層及海馬區(qū)α7 nAChR表達(dá)水平均升高，且隨劑量增加而升高，其中60mg/kg CC治療組、100mg/kg CC治療組及150mg/kg CC治療組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3）與6mg/kg CC治療組相比，60mg/kg CC治療組、100mg/kg CC治療組和150mg/kg CC治療組前額皮層及海馬區(qū)的α7nAChR表達(dá)量均增加，但只有100mg/kg CC治療組和150mg/kg CC治療組差異具有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義。4）100mg/kg CC組的前額皮層及海馬區(qū)α7 nAChR表達(dá)量較150mg/kg CC組下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5）前額皮層及海馬區(qū)α7 nAChR表達(dá)水平在60mg/kg CC治療組、100mg/kg CC治療組及150mg/kg CC治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　【結(jié)論】
　　1、Fmr1基因敲除小鼠與野生型小鼠比較，存在學(xué)習(xí)記憶障礙；
　　2、Fmr1基因敲除小鼠前額皮層、海馬區(qū)的α7 nAChR表