昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體的組成及其藥理學(xué)特性研究.pdf

1、煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)是脊椎動物和無脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)中快速介導(dǎo)膽堿能突觸傳遞的配基門控離子通道。在脊椎動物中，nAChRs在神經(jīng)肌肉接頭以及中樞和周緣神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)。在昆蟲中，nAChRs在神經(jīng)肌肉接頭處沒有分布，卻是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的神經(jīng)遞質(zhì)受體，是重要的殺蟲劑作用靶標(biāo)。目前通過分子克隆和基因組測序技術(shù)在多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)了大量的nAChRs亞基，為昆蟲nAChRs的研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在昆蟲nAChRs亞基功能研究

2、中，試圖體外組建昆蟲功能性nAChRs一直是國際研究熱點(diǎn)，但近20年來始終沒有突破，主要有兩個問題沒有解決:第一，昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中nAChRs蛋白復(fù)合體的組成仍然未知;第二，在異源表達(dá)系統(tǒng)中無法獲得有功能的昆蟲nAChRs同型五聚體。
　　 本文利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，對褐飛虱的四個nAChRsα亞基與大鼠的nAChRsβ2亞基進(jìn)行了體外重組，通過雙電極電壓鉗技術(shù)及放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究了重組型受體的藥理學(xué)特性，并利用免疫共

3、沉淀技術(shù)對昆蟲內(nèi)源性nAChRsα亞基的組成進(jìn)行了探索。通過搜索褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫及基因克隆獲得了兩個Ly-6/neurotoxin超家族基因，分別將其命名為Nl-lynx1和Nl-lynx2。在異源表達(dá)系統(tǒng)中檢測了這兩個lynx蛋白對重組型受體Nlα1/rβ2的調(diào)節(jié)作用，并對其調(diào)節(jié)機(jī)理進(jìn)行了研究。
　　 一、昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體α1、α2亞基的異源表達(dá)與功能研究吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑作為昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）

4、的選擇性激動劑，在農(nóng)業(yè)害蟲和衛(wèi)生害蟲的防治中應(yīng)用廣泛。褐飛虱（Nilaparvata lugens）是亞洲許多地區(qū)的主要水稻害蟲。本文在異源表達(dá)系統(tǒng)中對褐飛虱nAChRs兩個α亞基Nlα1和Nlα2進(jìn)行了體外重組，并對重組型受體的功能特性進(jìn)行了研究。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，Nlα1和Nlα2分別與哺乳動物的β2亞基共表達(dá)，均能夠形成有功能的受體，這與以往對于昆蟲α亞基的研究結(jié)果一致。兩種重組受體Nlα1/rβ2和Nlα2/rβ2對乙酰膽堿

5、的激動劑劑量反應(yīng)相差不足兩倍，但是，Nlα1/rβ2受體對吡蟲啉的親和力顯著高于Nlα2/rβ2受體，其EC50分別為61±7μM（n=9）和870±76μM（n=13）。
　　 在卵母細(xì)胞中同時表達(dá)Nlα1，Nlα2和哺乳動物的β2亞基，所形成的受體對激動劑的劑量反應(yīng)曲線介于Nlα1/rβ2受體和Nlα2/rβ2受體對激動劑的劑量反應(yīng)曲線之間，但又與計(jì)算機(jī)模擬的兩種受體同時存在時的劑量反應(yīng)曲線存在顯著差異，由此推測，N1α1，

6、Nlα2和哺乳動物的β2亞基可能組成一個三亞基五聚體Nlα1/Nlα2/rβ2。改變各亞基的注射比例，激動劑的EC50沒有顯著變化，進(jìn)一步證明三個亞基共表達(dá)時形成的受體不是亞基組成不同的nAChRs的混合物，而是單一的重組型nAChRs。為證明在褐飛虱體內(nèi)Nlα1和Nlα2兩個亞基是否存在于同一個受體中，進(jìn)一步研究昆蟲內(nèi)源性nAChRs的組成，本文分別以Nlα1和Nlα2亞基胞內(nèi)環(huán)的氨基酸序列為抗原制備特異性的多克隆抗體，進(jìn)行了免疫共沉

7、淀，研究結(jié)果證明，在褐飛虱體內(nèi)Nlα1和Nlα2亞基的確存在于同一個受體中。
　　 二、昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體α3、α8亞基的異源表達(dá)與功能研究昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）是以吡蟲啉為代表的新煙堿類殺蟲劑的作用靶標(biāo)。目前，通過基因組序列分析和基因克隆的方法在包括黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）在內(nèi)的多種昆蟲中鑒定出了大量的nAChRs亞基。系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析結(jié)果表明，果蠅Dβ2亞基與許多昆蟲的α

8、8亞基屬于同一個亞類群中。以往的研究中并沒有關(guān)于在異源表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)昆蟲α8/Dβ2亞類群nAChRs亞基的報道，但是，有證據(jù)表明Dβ2亞基可以與其它兩個亞基共聚，形成三亞基五聚體。
　　 本文通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了褐飛虱Nlα8亞基(GenBank登錄號:FJ481979)，并首次報道了包含昆蟲nAChRsα8亞基的三亞基五聚體Nlα8/Nlα3/rβ2。Nlα8亞基基因全長2036bp，開放閱讀框?yàn)?617

9、bp，編碼538個氨基酸，與意大利蜜蜂（Apis mellifera）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）的nAChRsα8亞基具有較高的相似性，且具有nAChRsα亞基基因家族的特征結(jié)構(gòu)。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，褐飛虱Nlα8亞基可以與哺乳動物β亞基rβ2共聚，形成重組型受體Nlα8/rβ2;也可以與Nlα3亞基及rβ2共聚，形成三亞基五聚體Nlα8/Nlα3/r

10、β2，且該受體對激動劑的劑量反應(yīng)顯著高于Nlα8/rβ2 nAChRs。Nlα8/Nlα3/rβ2對吡蟲啉的最大反應(yīng)電流Imax是Nlα8/rβ2的29.69倍。劑量依賴反應(yīng)的研究結(jié)果表明，Nlα8/rβ2對乙酰膽堿的EC50是Nlα8/Nlα3/rβ2的5.58倍，而Nlα8/rβ2對吡蟲啉的EC50約是Nlα8/Nlα3/rβ2的40倍。免疫共沉淀的研究結(jié)果進(jìn)一步證明，Nlα3與Nlα8亞基存在于同一個內(nèi)源性nAChRs中。

11、　　 三、昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體附屬蛋白的克隆及其對受體的調(diào)節(jié)作用在昆蟲體內(nèi)或離體條件下，除了nAChRs亞基組成外，一些附屬蛋白，包括分子伴侶，調(diào)控因子或調(diào)節(jié)蛋白，在昆蟲nAChRs的蛋白折疊與成熟、復(fù)雜結(jié)構(gòu)組成、蛋白功能等方面起到十分重要的作用。本文通過搜索褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫（http://bphest.dna.affrc.go.jp/;Noda et al.，2008）及基因克隆獲得了兩個Ly-6/neurotoxin超家族基因

12、，分別將其命名為Nl-lynx1和Nl-lynx2。Nl-lynx1和Nl-lynx2與螢火蟲Pr-lynx1基因的相似性分別為53％和50％，與小鼠lynx1基因的相似性分別為39％和41％，與小鼠lynx2基因的相似性分別為42％和44％。盡管褐飛虱Nl-lynx1和Nl-lynx2基因與螢火蟲的Pr-lynx1基因及脊椎動物的Ly-6/neurotoxin超家族的基因不具有較高的相似性，但是具有Ly-6/neurotoxin超家族

13、基因的特征結(jié)構(gòu)。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，Nl-Lynx1和Nl-Lynx2能夠上調(diào)重組型受體Nlα1/rβ2對激動劑反應(yīng)的最大電流，但是對受體對激動劑的敏感性沒有影響。Nl-Lynx1與重組型受體Nlα1/rβ2共表達(dá)時，受體對乙酰膽堿和吡蟲啉的Imax分別是單獨(dú)表達(dá)Nlα1/rβ2時的3.56倍和1.72倍;Nl-Lynx2與重組型受體Nlα1/rβ2共表達(dá)時，受體對乙酰膽堿和吡蟲啉的Imax分別是單獨(dú)表達(dá)Nlα1/rβ2時的3

14、.25倍和1.51倍。放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，Nl-lynx1或Nl-lynx2與受體Nlα1/rβ2共表達(dá)只能增加配基的最大結(jié)合量（Bmx）不改變受體與配基結(jié)合的平衡常數(shù)（Kd），即不改變受體對配基的親和力。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，Nl-lynx1或Nl-lynx2對受體的脫敏特性及nAChRs亞基表達(dá)水平?jīng)]有影響，且在一定范圍內(nèi)Nlα1/rβ2對激動劑的反應(yīng)電流隨Nl-lynx注射量的增加而增大，由此推測，Nl-lynx對受體的

15、調(diào)節(jié)作用可能是通過提高蛋白質(zhì)折疊和亞基組裝的效率實(shí)現(xiàn)的。
　　 本文的研究結(jié)果表明，兩種不同的昆蟲nAChRsα亞基共表達(dá)可以提高受體對激動劑的反應(yīng)，但仍需哺乳動物β亞基的參與才能夠在異源表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建功能受體;附屬蛋白與受體亞基共表達(dá)仍然不能形成有功能的受體，由此推測昆蟲nAChRs的蛋白復(fù)合體中尚有未知的蛋白需要鑒定，試圖體外組建昆蟲功能性nAChRs可能需要更多的未知附屬蛋白。因此，本研究通過免疫共沉淀分離純化包含某一亞基

16、的昆蟲內(nèi)源性nAChRs蛋白復(fù)合體，經(jīng)SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定的方法，對nAChRs蛋白復(fù)合體中的未知蛋白鑒定進(jìn)行了嘗試。雖然，由于抗體特異性等原因?qū)е妈b定出的蛋白數(shù)量過多，難以篩選出目的蛋白并對其功能進(jìn)行驗(yàn)證，但是，應(yīng)用免疫共沉淀，親和層析等方法對昆蟲nAChRs蛋白復(fù)合體進(jìn)行分離純化，結(jié)合基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過質(zhì)譜對其組分進(jìn)行鑒定的方法仍然具有可行性。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的技術(shù)手段，鑒定昆蟲nA