家蠶煙堿型乙酰膽堿受體與電壓門控鈉通道基因研究.pdf

1、昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)和電壓門控鈉離子通道(Voltage-gated sodium channel，VGSC)是昆蟲神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中的重要蛋白，分別為新煙堿類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)。鱗翅目是昆蟲綱第二大目，其幼蟲通常為植食性，其中有許多農(nóng)業(yè)害蟲。家蠶為鱗翅目模式生物，研究家蠶nAChR和電壓門控鈉通道對(duì)害蟲防治具有重要意義。 nAChR基因家

2、族通常含有十個(gè)以上的成員，這些成員的組合形成了nAChR復(fù)雜的分子類型，對(duì)生理功能的研究造成了很大困難。迄今為止，昆蟲nAChR未能通過(guò)自己亞基組合在爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，用于電生理學(xué)性質(zhì)的研究和農(nóng)藥篩選。本文對(duì)家蠶nAChR進(jìn)行了以下研究： 通過(guò)Blast檢索家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和RT-PCR、RACE技術(shù)，克隆了家蠶12個(gè)編碼nAChR亞基基因的全長(zhǎng)ORF。家蠶nAChR基因與果蠅nAChR基因相似性最高達(dá)86％；其中9個(gè)亞基亞基

3、為α型，3個(gè)亞基為β型；果蠅、岡比亞按蚊、蜜蜂和家蠶的α6亞基具有相同的內(nèi)含子位置。 亞基α4含有一對(duì)相互排斥的外顯子3，亞基α8含有一對(duì)相互排斥的外顯子7。亞基α8相互排斥的外顯子編碼TM2和TM3，迄今為止僅在家蠶中發(fā)現(xiàn)。α4截短的轉(zhuǎn)錄本缺少外顯子6～8，這些外顯子編碼LoopF和TM1-3。α5截短的轉(zhuǎn)錄本缺少外顯子4，導(dǎo)致下游閱讀框發(fā)生移碼和翻譯提前終止，只剩下一個(gè)很小的開放閱讀框，只有α6亞基上發(fā)現(xiàn)了五個(gè)RNA編輯位點(diǎn)

4、，5個(gè)堿基的RNA編輯(nts＃392，394，395，447，454)導(dǎo)致了四個(gè)氨基酸的變異(N131S,N132G,I149M,T152A)。 使用real-timePCR技術(shù)，對(duì)七個(gè)轉(zhuǎn)錄本在不同發(fā)育階段，幼蟲不同體段進(jìn)行了表達(dá)量分析。結(jié)果表明：所有轉(zhuǎn)錄本在頭部表達(dá)量最高，腹部表達(dá)量最低；所有轉(zhuǎn)錄本在蛹和成蟲階段的表達(dá)量都高于幼蟲。在胚胎期，轉(zhuǎn)錄本α4exon3、α7、β1的表達(dá)量高于幼蟲，而轉(zhuǎn)錄本α2、α8exon7a、α

5、8exon7b的表達(dá)量低于幼蟲，轉(zhuǎn)錄α4exon3表達(dá)量和幼蟲相當(dāng)。在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)了所有亞基的胞外受體片段，為受體相互作用研究打下了基礎(chǔ)。 通過(guò)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果和RT-PCR技術(shù)，克隆了家蠶鈉通道基因的全長(zhǎng)ORF，命名為BmNav。BmNavORF全長(zhǎng)6,258bp，編碼2,085個(gè)氨基酸殘基，含有34個(gè)外顯子。BmNav和果蠅、德國(guó)小蠊、人鈉通道氨基酸序列相似性分別為74％、77％、43％。家蠶鈉通道含有24個(gè)跨

6、膜螺旋，分屬于鈉通道的4個(gè)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有6個(gè)跨膜螺旋。 對(duì)胚胎、幼蟲、蛹、成蟲四個(gè)發(fā)育時(shí)期的BmNavPCR產(chǎn)物進(jìn)行超通量Solexa測(cè)序。測(cè)序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)RNA編輯，發(fā)現(xiàn)BmNav存在大量可變剪接.外顯子丟失除發(fā)生于結(jié)構(gòu)域之間的連接肽之外，還發(fā)生于膜結(jié)構(gòu)，可選擇性外顯子2、外顯子12和外顯子22i編碼結(jié)構(gòu)域之間的連接肽，它們的丟失不影響通道的保守結(jié)構(gòu)，不含外顯子2的轉(zhuǎn)錄本在四個(gè)發(fā)育時(shí)期的含量達(dá)到33％～55％，外顯子12