抗乙酰膽堿受體scFv基因克隆與表達(dá)的研究.pdf

1、重癥肌無力（Myasthenia gravis ，MG）是一種以神經(jīng)肌肉接頭（theneuromuscular junction ，NMJ）傳遞障礙為特征的自身免疫性疾病。80－85％的MG患者的血清中可檢測(cè)到抗乙酰膽堿受體的抗體（the nicotinicacetylcholine receptor antibody, AChRAb）。很多體外或被動(dòng)免疫的動(dòng)物模型的研究顯示這些抗體通過增加突觸后膜乙酰膽堿受體（human acetyl

2、cholinereceptor ,AChR）的降解率，誘導(dǎo)突觸后膜的補(bǔ)體介導(dǎo)損傷，或通過阻斷AChR的功能來減少功能性AChR的數(shù)量。重癥肌無力危象（Myasthenia crisis,MC）是MG的一種常見的威脅生命的并發(fā)癥，出現(xiàn)在大約15－20％的MG患者中，可以引起呼吸衰竭，需要進(jìn)行機(jī)械通氣治療。 將免疫球蛋白（immune globulin, Ig）的可變區(qū)進(jìn)行克隆可以獲得可變區(qū)Fv （variable fragment

3、）片段，這種分子兩條鏈間由于缺乏共價(jià)鍵或二硫鍵很容易解離。在VH 和VL之間連上一條連接鏈就會(huì)產(chǎn)生單鏈抗體（singlechain variable fragment，scFv）片段，這種片段在自然界中是不存在的，比Fv更穩(wěn)定，具備了抗體的特異性和折疊性，且免疫原性較低（它們具有人源性，分子較?。脖容^容易在其基因上貼上標(biāo)簽加以修飾。scFv已經(jīng)用作治療腫瘤和HIV。胞內(nèi)蛋白的錯(cuò)誤折疊和積累產(chǎn)生了很多種神經(jīng)變性性疾病,它們可成為有用的

4、胞內(nèi)抗體攻擊目標(biāo)。關(guān)于亨廷頓病的研究已經(jīng)使用了胞內(nèi)抗體技術(shù)，抗共核蛋白和β-淀粉樣蛋白的胞內(nèi)抗體研究也正處于早期階段。對(duì)于其他幾種神經(jīng)變性疾病包括帕金森病，阿爾茨海默病和朊病毒病的研究為胞內(nèi)抗體抗特異性目標(biāo)或可能性的下游目標(biāo)提供了新穎的治療方法。 抗AChR的主要免疫原區(qū)（the main immunogenic region ,MIR）的單價(jià)抗體能保護(hù)AChR免受MG血清中的自身抗體引起的損傷。希臘巴斯德研究所構(gòu)建并純化了功能

5、性的scFv 192和195片段。這些片段對(duì)人AChR呈現(xiàn)出很高的親和力（KD ＝0.6nM 和0.8 nM），比早期構(gòu)建的scFv198 （KD ＝80nM）高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。scFv192幾乎可以完全保護(hù)人AChR不與完整的抗MIR的mAb（monoclonal antibody,mAb）結(jié)合；scFv192也能有效保護(hù)74－84％的人AChR免于MG血清中自身抗體的結(jié)合，這兩種scFv在合適的基因修飾后可能成為保護(hù)MG患者體內(nèi)AChR

6、的強(qiáng)有力的候選試劑。但是，他們?cè)诒磉_(dá)這些scFv時(shí)使用的表達(dá)載體為質(zhì)粒pHEN1，這是一種噬菌體顆粒，其表達(dá)量較低，為了日后在分子水平治療MG，應(yīng)該獲得較大量表達(dá)。 在以往研究的基礎(chǔ)上，本研究擬采用大腸桿菌表達(dá)Trx融合蛋白的方式來表達(dá)大鼠scFv1929＃，以期得到較大量的可溶性表達(dá)產(chǎn)物，主要結(jié)果如下： 用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增scFv1929?；? 將PCR產(chǎn)物再定向克隆至載體pET32a(+)的多克隆位點(diǎn)中，

7、構(gòu)建了表達(dá)載體pET32a(+)-scFv1929＃,經(jīng)PCR及酶切鑒定正確, 片段大小為730 bp,與預(yù)期的730 bp接近，經(jīng)測(cè)序反應(yīng)確定無誤。 所構(gòu)建質(zhì)粒pET32a(+)-scFv1929＃ 轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株內(nèi),對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行2種不同溫度和IPTG濃度誘導(dǎo)后,裂菌,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Western Blot,WB）進(jìn)行鑒定