乙酰膽堿受體的重組表達以及抗AChR抗體檢測方法的建立.pdf

1、重癥肌無力(MG)是一種對神經肌接頭處煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinicacetylcholinereceptor,nAChR)產生免疫反應的自身免疫性疾病。抗nAChR抗體激活的補體攻擊反應可以導致nAChR甚至突觸后膜的破壞,從而引起神經肌肉傳導功能障礙。
　　煙堿型乙酰膽堿受體為配體門控離子通道超家族成員之一,在神經肌肉接頭中的突觸后膜上介導化學信號向電信號的快速轉化。這一家族蛋白包括甘氨酸受體、γ-氨基丁酸受體、谷氨酸

2、受體及5-羥色胺受體。電鰩電器官及骨骼肌中的nAChR為較大的(Mr約290kDa)四種同源亞基組成的五聚體,電鰩及胚胎肌肉中為α12β1δγ,成人肌肉中為α12β1δε。亞基按α1-γ-α1-δ-β1的順序形成一個圓柱形離子通道復合體。每個亞基都是一條多肽鏈,從N端到C端依次為:1個較大的N-末端胞外域(extracellulardomain,ECD),3個跨膜域,1條較大的胞內環(huán),第4個跨膜域和1個C-端尾位于胞外。nAChRN-末

3、端胞外域對受體激動劑及競爭性拮抗劑都具有較高的親和力。神經遞質ACh主要作用在α1γ亞基和α1δ亞基交界處的兩個不對等位點,而α-銀環(huán)蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-BTx)與nAChR的結合位點則主要是α1亞基N-末端胞外域。并且,α1亞單位胞外域還包括了主要免疫原區(qū)(mainimmunogenicregion,MIR),是刺激重癥肌無力患者形成nAChR抗體的主要位點。外源注射nAChR能使動物產生nAChR抗體,并表現出

4、重癥肌無力癥狀,即免疫重癥肌無力主動免疫動物模型。將來還有可能將nAChR用于結合重癥肌無力患者血清內的致病抗體,從而達到去除致病抗體,緩解臨床癥狀。
　　有研究稱,利用放射免疫法(RIA)檢測MG患者血清抗-AChR抗體含量,以此作為診斷標準,其診斷敏感性為88％,且不同MG分型的陽性率也有所區(qū)別:早發(fā)眼肌型MG為71%,晚發(fā)眼肌型為88%,早發(fā)全身型為89%,晚發(fā)全身型為98%。而抗-AChR抗體陽性診斷MG的特異性高達99.

5、9%。但是,目前國內沒有將檢測抗-AChR抗體作為常規(guī)診斷方法,通過我們的研究,我們成功建立了穩(wěn)定的抗-AChR抗體放射免疫檢測法,并希望該方法能與臨床診斷相結合,提高MG診斷效率。
　　實驗性自身免疫性重癥肌無力(Experimentalautoimmunemyastheniagravis,EAMG)是發(fā)生在大鼠身上的,T細胞依賴的抗體介導的自身免疫性疾病,且整個免疫過程是單純針對nAChR的免疫反應。作為研究重癥肌無力的重要研

6、究手段,EAMG模型的構建依然是我們研究該領域的重要基礎。目前構建EAMG模型的原材料主要有兩種:一種是電鰩電器官,一種是哺乳動物的去神經支配肌肉。目前在國內,電鰩價格昂貴且難以獲取,而大鼠去神經支配術復雜且獲取量少,所以我們考慮用重組表達nAChR的方法獲得穩(wěn)定且具有生物學活性的蛋白。本實驗共嘗試了兩種方法表達nAChR:CHO①細胞表達人乙酰膽堿受體α亞單位胞外域。以nAChRα1基因全長為模板,PCR法擴增nAChRα1亞基ECD

7、1-216,酶切后裝入pcDNA3.1表達載體中,脂質體轉染入CHO細胞,分別在轉染后6~72h的7個時間點進行熒光實時定量PCR鑒定ECD基因的表達水平,利用125I標記的銀環(huán)蛇毒素測定細胞培養(yǎng)上清中ECD蛋白的表達。②大腸桿菌表達含三個突變堿基的大鼠乙酰膽堿受體α亞單位胞外域。將大鼠AChRα1亞基胞外域蛋白中三個氨基酸進行突變,分別為Val8Glu,Trp149Arg,Val155Ala,送公司合成上述基因。將合成基因插入pET-