肌肉松弛藥對大鼠乙酰膽堿受體影響的實驗研究.pdf

1、第一部分非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)大鼠肌肉乙酰膽堿受體的方法學(xué)研究　　目的：建立適合于研究肌肉松馳藥在乙酰膽堿受體上作用的實驗?zāi)Ｐ?。　　方法：利用電壓鉗方法記錄非洲爪蟾卵母細(xì)胞的未去膜組、去膜未轉(zhuǎn)染組和去膜轉(zhuǎn)染組電壓依賴性的離子通道電流，觀察并分析三組電流特性。結(jié)果三組卵母細(xì)胞的靜息膜電位和鉗制到-60mV時的補償電流無統(tǒng)計學(xué)差別，通過去除卵母細(xì)胞的卵泡膜可以去除內(nèi)源性受體的干擾，在注射大鼠肌肉多聚腺嘌呤poly(A)+mRNA的卵母細(xì)胞

2、膜上記錄到典型的大鼠骨骼肌煙堿型乙酰膽堿受體(NicotinicacetylcholinereceptornAChR)的電流。 結(jié)論：本實驗建立的模型為在細(xì)胞和蛋白水平研究肌松藥的藥理、毒理作用奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。 第二部分揮發(fā)性吸入麻醉藥、鏈霉素對非去極化肌松藥與肌肉型乙酰膽堿受體作用的影響 目的：探討揮發(fā)性吸入麻醉藥、鏈霉素對非去極化肌松藥作用效能影響的可能機(jī)制。 方法：從大鼠肌肉提取多聚腺嘌呤

3、poly(A)+mRNA，注入去膜的非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)有功能的離子通道，利用電壓鉗技術(shù)記錄轉(zhuǎn)染后卵母細(xì)胞電壓依賴性離子通道電流。以不同濃度乙酰膽堿(ACh)刺激轉(zhuǎn)染后的卵母細(xì)胞，建立Ach-離子通道電流的量效曲線。再分別觀察異氟醚、七氟醚、鏈霉素和維庫溴銨、羅庫溴銨等對ACh-離子通道電流的抑制作用，計算各種藥物的50％抑制率濃度(50％Inhibitionconcerntration，IC50)。然后觀察相當(dāng)于IC50異氟醚(七氟醚

4、或鏈霉素)聯(lián)合羅庫溴銨(維庫溴銨)使用對ACh-離子通道電流的抑制作用。 結(jié)果：異氟醚、七氟醚、羅庫溴銨和維庫溴銨均能快速、穩(wěn)定、可逆、濃度依賴性地抑制ACh(10μM)引起的全細(xì)胞電流，其IC50分別是889μmol/L(95％CI：711～1214μmol/L)、823μmol/L(95％CI：681～997μmol/L)、33.4nmol/L(95％CI：27.1～41.7nmol/L)和9.20nmol/L(95％CI：

5、7.90～12.3nmol/L)。聯(lián)合使用異氟醚(七氟醚)和非去極化肌松藥時，異氟醚、七氟醚均可顯著增強(qiáng)非去極化肌松藥抑制膜電流效應(yīng)。鏈霉素也能濃度依賴性地抑制ACh(10μM)引起的全細(xì)胞電流，在高濃度(＞5mmol/L)時鏈霉素完全抑制ACh誘發(fā)的電流，IC50濃度為570μmol/L，95％CI為421～914μmol/L，但增加ACh濃度不能完全克服鏈霉素對電流的抑制。 結(jié)論：異氟醚、七氟醚能協(xié)同增強(qiáng)非去極化肌松藥抑制A

6、Ch誘導(dǎo)的已轉(zhuǎn)染nAChR卵母細(xì)胞膜電流作用，其機(jī)制可能是在受體水平增加非去極化肌松藥的親和力。鏈霉素自身抑制膜電流能力很弱，能明顯增加臨床劑量范圍內(nèi)的非去極化肌松藥抑制效應(yīng)，這兩類藥物的作用位點是獨立的，不同的，相互作用方式是單純加和作用，其作用機(jī)理主要是鏈霉素通過進(jìn)入離子通道內(nèi)部產(chǎn)生阻塞作用。 第三部分發(fā)育與衰老過程中大鼠骨骼肌乙酰膽堿受體變化的研究 目的：探討大鼠骨骼肌nAChR在發(fā)育、衰老過程中數(shù)量、亞型種類及

7、功能的變化。 方法：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)半定量法檢測大鼠胎鼠組(n=8)、2周組(n=18)及4周組(n=20)骨骼肌肉nAChR的ε、γ亞單位的表達(dá)量。分別從三組大鼠肌肉提取多聚腺嘌呤poly(A)+mRNA，注入去膜的非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)有功能的離子通道，采用電壓鉗技術(shù)比較乙酰膽堿誘發(fā)的三組卵母細(xì)胞的nAChR電流特征和維庫溴銨對之的影響。同樣的方法檢測青年組大鼠(n=12)、中年組大鼠(n=15)、老年早期

8、組大鼠(n=9)和老年晚期組大鼠(n=7)骨骼肌nAChRε亞單位的表達(dá)。比較組間乙酰膽堿誘發(fā)的轉(zhuǎn)染后卵母細(xì)胞nAChR電流和維庫溴銨與受體作用引起峰電流的變化。 結(jié)果：隨大鼠鼠齡增加，大鼠肌肉nAChRγ亞單位表達(dá)量進(jìn)行性下降，且在4周組沒被檢測出(P＜0.05)；ε亞單位表達(dá)量進(jìn)行性升高(P＜0.05)。維庫溴銨抑制三組IC50濃度分別是58.1±21.3、48.9±13.2、(9.32±4.74)nmol/L。與青年組比較

9、，老年早期組和老年晚期組大鼠骨骼肌肉n-AChRε亞單位表達(dá)量進(jìn)行性下降(P＜0.05)。老年早期和老年晚期組ACh激動nAChR的EC50值明顯高于青年組、中年組(P＜0.05)。維庫溴銨對青年組、中年組和老年早期組大鼠肌肉的nAChR作用強(qiáng)度無差異，但對老年晚期組大鼠肌肉的nAChR作用強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。 結(jié)論：骨骼肌乙酰膽堿受體在發(fā)育過程中γ亞單位逐漸由ε亞單位代替，并在4周時γ亞單位已消失。ε-nAChR對維