褪黑素和M膽堿受體激動劑、拮抗劑對大鼠肝星狀細胞作用的研究.pdf

1、目的：通過CCl<,4>誘導的HF (hepatic fibrosis，HF)大鼠模型，觀察MT對模型大鼠肝臟病理學檢查、實驗室檢查、HF指標的作用；鑒于肝星狀細胞 (hepatic stellatecells，HSC)在HF中的核心作用，通過體外實驗，初步探討MT和M膽堿受體激動劑硝酸毛果蕓香堿(pilocarpine nitrate，PN)拮抗劑硫酸阿托品(atropine sulfate，AS)對HSC形態(tài)學、合成或分泌細胞外基質(zhì)

2、、細胞凋亡等生物學行為的影響，以期今后進一步研究MT、PN、AS對HF作用機制，并為開發(fā)治療HF的藥物提供實驗室依掘。 方法：予SD大鼠背部皮下注射CCl<,4>制備HF模型。 體內(nèi)實驗：MT組大鼠灌胃，給予MT (0.125、0.5、2.0 mg/(kg·d))8 wk，全自動生物化學分析儀 (automaticbiochemical analyzing equipment，A-BAE) 檢測生化指標，放射免疫分析法(

3、radioimmunoassay,RIA) 檢測血清透明質(zhì)酸 (hyaluronic acid，HA) 與Ⅲ型前膠原(precollagen type Ⅲ，PCⅢ)，HE染色觀察病理改變； 體外實驗：從HF模型組來源的HSC給予MT(10、0.1μmol/L、l nmol/L)，PN(1 mmol/L、10、0.1 μmol/L)，AS(1 mmol/L、10、0.1 μmol/L)，MT(10μmol/L)+PN(1 mmol

4、/L、10、0.1μmol/L)，MT(10 μmol/L)+AS(1 mmol/L、10、0.1μmol/L)；從正常組來源的HSC給予生理鹽水。培養(yǎng)48 h后，光鏡下觀察細胞爬片后HSC形態(tài)學改變；流式細胞術(flowcytometry,FCM)檢測HSC凋亡率，RIA檢測培養(yǎng)上清中HA、PCⅢ水平。從HF模型組來源的HSC給予PN(10μmol/L)，MT(10 μmol/L)+PN(10 μmol/L)，MT(0.1 μmol/

5、L)+PN(10μmol/L)，陰性對照組給予等劑量無血清DMEM，培養(yǎng)48h后，逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應 (reverse transcriptase polymerase chainreaction，RT-PCR)檢測Ⅰ型膠原mRNA(collagen typeⅠmRNA，ColⅠmRNA)表達。 結(jié)果： 1.MT對CCl<,4>誘導的HF大鼠實驗室檢查指標、HF指標、肝臟病理的影響 1.1 MT對CCl<,4

6、>誘導的HF大鼠實驗室檢查指標的影響 CCl<,4>造模12 wk后，與正常組大鼠比較，HF模型組大鼠TP、ALB含量顯著減少、A/G顯著降低，ALT、AST和ALP含量均顯著增加。與HF模型組大鼠比較，CLC組大鼠ALB顯著增加、A/G升高，ALT和ALP均顯著降低；MT(0.5 mg/(kg·d)，8 wk)組大鼠TP增加，MT各劑量組大鼠ALB顯著增加、A/G升高，ALT、AST和ALP均顯著降低。與CLC組大鼠比較，MT

7、(0.5 mg/ (kg·d)，8 wk)組TP、ALB顯著增加(p<0.05)；MT(2.0 mg/(kg·d)，8 wk)組ALT水平較高(p<0.05)。 1.2 MT對CCl<,4>誘導的HF大鼠HF指標的影響 CCl<,4>造模12 wk后，與正常組大鼠比較，HF模型組大鼠HA、PCⅢ水平明顯升高；與HF模型組大鼠比較，CLC組、MT各劑量組大鼠HA、PCⅢ水平明顯降低；與CLC組比較，MT高劑量組HA水平較高

8、，而中劑量組的較低。 1.3 MT對CCl<,4>誘導的HF大鼠肝臟病理的影響 CCl<,4>造模12 wk后，與正常組大鼠比較，HF模型組大鼠肝細胞皺縮、腫脹、壞死，界限不清，細胞排列紊亂，可見脂肪變性改變；纖維組織增生并穿插進入肝細胞間隙，炎性細胞浸潤及血管翳形成。CLC組、MT各劑量組均可不同程度改善病理改變。 2．MT、PN、AS對的HSC形態(tài)學影響 體外用藥培養(yǎng)細胞48 h后，正常大鼠來源的正常

9、對照組HSC幾乎鋪滿爬片；與正常對照組HSC比較，HF大鼠來源的模型組HSC幾乎鋪滿爬片，生長良好；與模型組比較，MT各劑量組HSC稀疏，AS各劑量組部分細胞皺縮， MT與AS聯(lián)合用藥組HSC稀疏，部分細胞皺縮；而PN各劑量組HSC稠密鋪滿爬片，生長良好；MT與PN聯(lián)合用藥組HSC幾乎鋪滿爬片，生長較好，可見少量細胞皺縮。 3．MT、PN、AS對HSC凋亡的影響 細胞體外用藥48 h后，與正常對照組HSC比較，模型組HS

10、C凋亡率明顯增加；與模型組比較，MT(10 μmol/L)，PN、AS各劑量組，MT(10 μmol/L)+AS(10、0．μtmol/L) 凋亡率顯著增加(P<0.05)，MT (10μmol/L)+PN(10μmol/L)組凋亡率顯著降低(P<0.05)。 4．MT、PN、AS對HSC合成或分泌HA、PCⅢ的影響 細胞體外用藥48 h后，與正常對照組HSC比較，模型組HSC中HA、PCⅢ水平明顯升高；與模型組比較，M

11、T、AS各濃度組、MT與AS聯(lián)合用藥組HA、PCⅢ水平顯著降低；而PN、MT與PN聯(lián)合用藥組HA水平顯著升高，PCⅢ水平無明顯差異。 5．MT、PN對HSC表達ColⅠmRNA的影響 PN促進HSC表達ColⅠmRNA，而MT能夠抑制PN的促進作用。 結(jié)論： 1．MT對CCl<,4>誘導的大鼠HF損傷有明顯改善作用，能有效保護肝臟。 本課題實驗成功建立了CCl<,4>誘導的大鼠化學性損傷模型，以體

12、內(nèi)實驗，證明了在HF時，MT不同劑量(0.125、0.5、2.0 mg/(kg·d)，8 wk)能不同程度升高反映肝臟合成功能的蛋白質(zhì)(TP、ALB)水平，降低反映代謝功能的肝功能酶(AST、ALT、ALP)水平；減少反映HF的血清HA、PCⅢ含量；MT不同劑量均能有效改善肝臟病理損傷。結(jié)果充分說明了MT能夠在肝臟功能、形態(tài)等方面發(fā)生損傷情況下，改善甚至逆轉(zhuǎn)肝臟損傷。同時，病理學等結(jié)果提示，MT在中劑量(0.5 mg/(kg·d)，8

13、wk)時，可有效保護肝臟。 2.MT可能通過誘導HSC凋亡、抑制HSC合成或分泌HA、PCⅢ等機制發(fā)揮抗HF作用。 本課題實驗，結(jié)合體內(nèi)、體外兩種環(huán)境，探討了MT對反映HF時ECM改變的指標HA、PCⅢ的影響；證實了M丁在體內(nèi)外均能夠有效降低HA、PCⅢ水平，并在體外抑制PN的促進ColⅠmRNA表達作用，提示MT在影響HSC合成或分泌ECM階段，發(fā)揮抗HF作用；同時，觀察了MT對HSC凋亡作用，證實MT(10 μmol

14、/L)能顯著促進HSC凋亡，應當是MT能改善HF的主要機制：此外，實驗結(jié)果還提示，MT抑制HSC合成或分泌ECM作用，并不完全依賴誘導HSC凋亡作用，在較高濃度范圍內(nèi)，才表現(xiàn)出明顯的誘導凋亡效應：而在較低濃度時，已能抑制HSC合成或分泌ECM。 3.M膽堿能受體激動劑PN、拮抗劑AS參與了對HSC凋亡、合成或分泌ECM的調(diào)控。 體外實驗中觀察了M膽堿能受體激動劑PN、拮抗劑AS對HSC的影響，發(fā)現(xiàn)PN不同濃度(1 mmo

15、l/L、10、0.1μmol/L)均能促進HSC合成或分泌HA，PN(10 μmol/L)還能促進ECM中重要成分Col Ⅰ的mRNA表達，有力佐證了PN能夠促進HSC增殖，同時引起凋亡活動相應活躍；拮抗劑AS(1 mmol/L、10、0.1μmol/L)能夠有效減少HA、PCⅢ含量，并引起HSC凋亡增加。結(jié)合M膽堿能受體激動劑PN、拮抗劑AS的作用，證實兩者參與了對HSC凋亡、合成或分泌ECM的調(diào)節(jié)，并提示影響M膽堿能受體，可以調(diào)控H