細(xì)胞凋亡及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

1、第六部分 細(xì)胞凋亡 及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)PartⅥ Apoptosis and its signal transduction,2,內(nèi)容,一、細(xì)胞凋亡概述二、細(xì)胞凋亡的機(jī)理三、細(xì)胞凋亡途徑四、細(xì)胞凋亡的意義,3,一、細(xì)胞凋亡概述,1.細(xì)胞凋亡概念 1965年澳大利亞科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實(shí)質(zhì)組織中有一些散在的死亡細(xì)胞, 其溶酶體并未被破壞，顯然不同于細(xì)胞壞死。這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝

2、集從其周圍的組織中脫落并被吞噬機(jī)體無炎癥反應(yīng)。1972年Kerr等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡的概念，宣告了對細(xì)胞凋亡的真正探索的開始，在此之前，關(guān)于胚胎發(fā)育生物學(xué)、免疫系統(tǒng)的研究，肝細(xì)胞死亡的研究都為這一概念的提出奠定了基礎(chǔ)。細(xì)胞凋亡(apoptosis) ，又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD) ：一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程。壞死（性）（necrosis）:由某些外界因素比如局部

3、貧血，高熱以及物理、化學(xué)損傷和生物侵襲等造成細(xì)胞急速死亡，是一種被動性死亡。,4,2.細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡比較,5,3.程序性細(xì)胞死亡的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,6,程序性死亡細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,7,1）DNA的有控裂解: 200bp及其倍數(shù)DNA 條帶2）組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（tTG）積累并達(dá)到較高水平。其活性依賴鈣離子，參與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚合，有助于保持凋亡小體暫時的完整性，防止有害物質(zhì)逸出。3）細(xì)胞內(nèi)鈣離子快速、持續(xù)升高。其

4、它：細(xì)胞內(nèi)活性氧增多，質(zhì)膜通透性變大。,4.程序性細(xì)胞死亡的生化特征,8,,程序性死亡細(xì)胞的DNA降解,9,5. 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子,1）物理性因子：射線，較溫和的溫度刺激（熱激、冷激）。2）化學(xué)及生物因子：活性氧、鈣離子載體、VK3、視黃酸、細(xì)胞毒素、DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑、正常生理因子（如激素、細(xì)胞生長因子）的失調(diào)、腫瘤壞死因子、抗Fas/Apo-1/CD95抗體、細(xì)菌、病毒等。,10,11,6. 細(xì)胞凋亡的檢測,1）形態(tài)學(xué)檢

5、測：普通光鏡、熒光顯微鏡、透射和掃描電鏡觀察2）DNA梯形電泳圖譜檢測：細(xì)胞凋亡數(shù)超過30%3）彗星電泳法：單個細(xì)胞懸浮于凝膠中，裂解后電泳形成彗星式圖譜，無斷裂DNA保持圓球形4）TUNEL檢測，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記5）流式細(xì)胞檢測：碘化丙錠使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光6）Annexin V法：熒光素標(biāo)記PS特異性結(jié)合蛋白Annexin V7）線粒體膜勢能的檢測：其跨膜電位下

6、降是凋亡發(fā)生的早期事件，用親脂性陽離子熒光染料如羅丹明123結(jié)合線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)弱反映內(nèi)膜電負(fù)性高低,12,二、 程序性細(xì)胞死亡的機(jī)理,◆2002年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎：英國的Brenner、Sulston和美國的Horvitz●for their discoveries concerning "genetic regulation of organ development and programmed cell

7、death",13,1.雌雄同體的秀麗新小桿線蟲,14,2.秀麗新小桿線蟲中參與程序性細(xì)胞死亡控制的基因,●決定死亡的兩個基因，即ces-1(ces表示CE細(xì)胞存活的調(diào)控基因)和ces-2基因?！駡?zhí)行死亡的4個基因：ced-3、ced-4、ced-9和egl-1基因?！?個與死亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞所吞噬的基因，即ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-10和ced-11?！袼劳黾?xì)胞在吞噬體中被降

8、解的基因:nuc-1。,15,程序性細(xì)胞死亡途徑及相關(guān)基因,16,3. 凋亡促進(jìn)基因,1）BAX：C端與BCL2相似，與BAX蛋白量的比率決定細(xì)胞命運(yùn)，BCL2高表達(dá)時形成異二聚體抑制凋亡。2）BAK：功能類似BAX，拮抗BCL2、BCL-XL、E1B-19K的抗凋亡效應(yīng)。3）BAD：置換BCL-XL/BAX、BCL2/BAX中的BAX，使BAX同二聚體含量升高。,17,BcL-Xs，Bad, Bid, Bik，Hrk，Bim, B

9、lk, ,Noxa,BimL,BcL-2,BcL-w，BcL-XL、 MCL-1，AI, BFL-1、Brag-1、NR-13,BOO,Bax，Bak, Bok，,抗凋亡結(jié)構(gòu)域,,18,4）天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartatespecific protease),簡稱caspase ：自殺性蛋白水解酶◆白細(xì)胞介素-1β-轉(zhuǎn)換酶（ICE， caspase1 ）：與ced3同源，促使I

10、L-1β前體轉(zhuǎn)換成有活性的IL-1β 。 ◆ caspase1、 11、4參與白介素前體的活化◆ caspase2、8、9、10參與細(xì)胞凋亡的起始◆ caspase3、6、7參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行,3. 凋亡促進(jìn)基因,,,凋亡蛋白 — Caspase 家族,20,3.凋亡促進(jìn)基因,5）腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）：TNF家族成員，發(fā)現(xiàn)5個TRAIL受體，DR4、DR5胞內(nèi)含死亡結(jié)構(gòu)域（dead domain,DD）。

11、6）Fas/Apo1/CD95：TNFR/NGFR家族成員，編碼52kD跨膜蛋白，胞質(zhì)區(qū)有信號傳導(dǎo)區(qū)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制區(qū)，其配體FasL屬TNF家族成員。7) TNFR1死亡結(jié)構(gòu)域連接蛋白（TRADD）： 32kD ，C端有DD，可和TNFR1特異性結(jié)合，被ICE蛋白酶的特異性抑制劑CrmA抑制；可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。,21,3.凋亡促進(jìn)基因,8）Fas死亡結(jié)構(gòu)域連接蛋白（FADD）： 208aa ，C端有DD，與 Fas/Apo1

12、結(jié)合，N端含MORT結(jié)構(gòu)域或死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED），可與MACH/FLICE（caspase 8）結(jié)合，向下轉(zhuǎn)導(dǎo)Fas及TNF1 2個受體的細(xì)胞凋亡信號。9）受體相互作用蛋白（RIP）： 74kD， C端有DD， N端與蛋白激酶同源，可與Fas及TNF1 2個受體結(jié)合。10）Daxx： 81kD， C端可與Fas的DD結(jié)合， N端可激活JNK途徑。,22,4. 凋亡抑制基因,1）BCL2：原癌基因，ced9的同源物。C端含19aa

13、組成的跨膜結(jié)構(gòu)，位于線粒體、SER、核膜。穩(wěn)定線粒體，阻遏氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，阻斷從ER向胞質(zhì)的鈣流。2）BCL-X：BCL-XL與線粒體結(jié)合，抑制細(xì)胞色素C釋放；與Apaf-1結(jié)合，抑制其形成復(fù)合物。BCL-Xs可與BCL2 、BCL-XL組成異二聚體。3）MCL-1：與BCL2同源，可與BAX形成異二聚體。4）A1：與BCL2同源，可與BAX形成異二聚體。,23,5. 細(xì)胞生長抑制基因,P53通過調(diào)節(jié)BCL2和BAX基

14、因的表達(dá)來影響細(xì)胞凋亡。 P53抑制BCL2表達(dá)，促進(jìn)BAX表達(dá)。正常發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡并不要求P53參與。,24,6. 細(xì)胞增殖基因,c-Myc在抑制細(xì)胞周期因子、抑癌基因、低濃度血清培養(yǎng)條件下，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在GF充足時主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因。作用：拮抗Fas/ Fas L途徑中的凋亡抑制因子；作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)Fas/ Fas L的表達(dá)。,25,7.動物細(xì)胞中蛋白質(zhì)酶解級聯(lián)系統(tǒng)對程序性細(xì)胞死亡的介導(dǎo),26,8.執(zhí)行者ca

15、spase在程序性細(xì)胞死亡中的作用,27,◆能夠被caspase切割的靶蛋白●蛋白激酶●核纖層蛋白●細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白●與DNA修復(fù)相關(guān)的酶類：多聚ADP核糖聚合酶●caspase激活的DNase抑制蛋白：ICAD/DEF45,A. 使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICADB. 破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如LaminaC. 將調(diào)節(jié)區(qū)與催化區(qū)分離，使蛋白失活，如Gelsolin,28,◆ caspase8、10含串聯(lián)重復(fù)的“死亡效應(yīng)子”結(jié)構(gòu)域（

16、DED）◆caspase2、9含caspase募集結(jié)構(gòu)域（CARD）◆ 連接器FADD◆ 修飾子蛋白TRADD◆ Apaf-1(apoptotic protease activating factor-1,凋亡蛋白酶活化因子-1),9. caspase的活化,caspase 激活模型,30,caspase的抑制劑,痘病毒蛋白Crm A抑制caspase 1、8桿病毒蛋白p35對大多數(shù)有較強(qiáng)抑制作用,主要作用于起始caspase

17、γ皰疹病毒v-PLIPs：一組受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制劑，含兩個DED，可與FADD相互作用，阻止caspase 8、10與連接器蛋白的結(jié)合及活化。細(xì)胞凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis protein, IAP）：抑制caspase 3、7、9，對caspase 1、8、10無抑制作用。N端為桿狀病毒IAP重復(fù)序列(baculoviral IAP repeat, BIR結(jié)構(gòu)域):與caspase結(jié)合; C端鋅

18、指結(jié)構(gòu)域: 可作為E3泛素連接酶,31,A、氧化損傷（自由基的作用）,1）引起DNA損傷可激活P53基因?qū)е录?xì)胞凋亡。2）引起DNA損傷可活化多聚ADP核糖合成酶， 引起NAD快速消耗，ATP大量消耗，引發(fā)細(xì) 胞凋亡。3）引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，直接造成細(xì)胞膜損傷 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4）激活核酸內(nèi)切酶。5）引起細(xì)胞膜通透性增高（ Ca2+內(nèi)流增加） 和線粒體膜損傷6）活化核轉(zhuǎn)錄因子，可加速凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。

19、,10.細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制,32,B、鈣穩(wěn)態(tài)失衡,1）激活Dnase,2）激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)胞內(nèi)肽鏈間的?；D(zhuǎn)移，使蛋白廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成。,3）激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。,4）Ca 2+在ATP的配合下使DNA舒展，暴露出核小體之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點(diǎn)。,5）激活Ca2＋ 敏感的蛋白酶,33,C、線粒體損傷,凋亡誘導(dǎo)因素,,線粒體跨膜電位↓,,線粒體PTP開放,,Cyt.C,Apaf,等釋放,,凋亡

20、誘導(dǎo)因子（AIF）,,,潛在Dnase,活化Dnase,,激活Caspases,,細(xì)胞凋亡,,（通透性轉(zhuǎn)換孔）（凋亡蛋白酶激活因子）,34,三、細(xì)胞凋亡途徑,1. 死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑（外源性死亡通路 ）,死亡受體:● CD95 (或者Fas)● TNFR1 (TNF receptor-1) ● DR4 和 DR5,35,2. 細(xì)胞色素c/凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease-activating

21、 factor，Apaf）途徑 （內(nèi)源性死亡通路 ）,36,37,38,39,細(xì)胞內(nèi)源信號激發(fā)細(xì)胞程序性死亡,40,41,3. Ras-PI3K-Akt(PKB)抗細(xì)胞凋亡途徑,42,4. NF-κB與細(xì)胞凋亡,NF-κB：一種轉(zhuǎn)錄因子，抑制細(xì)胞凋亡。Ras可促進(jìn)NF-κB活化。TNFR激活后，通過TRADD、RIP、TRAF2激活NIK（ NF-κB誘導(dǎo)激酶），再激活I(lǐng)KK（IκB激酶），將IκB磷酸化降解，釋放N

22、F-κB進(jìn)入核內(nèi)。NF-κB的靶基因?yàn)門RAF1（TNFR結(jié)合因子1）、TRAF2、c-IAP（細(xì)胞凋亡抑制因子）1和c-IAP2 ，共同作用，抑制caspase 8的活化而抑制細(xì)胞凋亡。,43,5. ASK1-SAPK/JNK及ASK1-p38途徑,ASK1：一種MAPKKK，參與脅迫和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。JNK、p38都是 MAPK。ASK1可活化MKK4-JNK 和MKK3-p38兩條信號通路。TNFR可通過接頭蛋白與

23、MEKK結(jié)合而激活JNK通路。,47,6.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號途徑,◆ Bcl-2蛋白家族成員可定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高表達(dá)Bcl-2可有效阻止Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的釋放◆ Ca2+胞內(nèi)可作為促凋亡的第二信使參與啟動凋亡◆ caspase-12可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被激活，進(jìn)一步切割caspase-3,9,48,7. 非caspase依賴的細(xì)胞凋亡,◆非caspase依賴的細(xì)胞凋亡：自吞噬性細(xì)胞死亡和壞死◆ AIF (apootosis inducing facto

24、r):線粒體內(nèi)保守的氧化還原酶，是可直接介導(dǎo)細(xì)胞核凋亡的效應(yīng)分子。作用于染色質(zhì)，在caspase dependent DNAse進(jìn)一步催化下，DNA呈大片段斷裂(-50kb)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡?！?Cathepsins:溶酶體蛋白酶，可激活線粒體細(xì)胞凋亡通路和非caspase依賴的細(xì)胞凋亡◆ Calpains:受Ca2+調(diào)控的蛋白酶，可切割和激活caspase-12，也參與非caspase依賴的細(xì)胞凋亡◆ Granzyme B:可直

25、接激活caspase ，也能誘導(dǎo)非caspase依賴的細(xì)胞凋亡,50,四、程序性細(xì)胞死亡的意義,◆動物機(jī)體靠對細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的正負(fù)控制以及對程序性細(xì)胞死亡的正負(fù)控制來維持細(xì)胞總數(shù)的平衡和機(jī)體的生命活力?！舫绦蛐约?xì)胞死亡在形態(tài)建成中起重要作用。,51,細(xì)胞凋亡是普遍存在的,? 變態(tài)： 蝌蚪 ?? 青蛙 昆蟲 、卵 ? 幼蟲 ? 成蟲,? 哺乳類: 皮膚，指（趾）甲,? 紅細(xì)胞：分化成熟 ? 失去細(xì)胞核 ? 凋亡,?

26、 淋巴細(xì)胞：95% 以上在成熟之前死去， 不到 5% 成熟后只存活一至幾天,? T—細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制之一， 就是誘使靶細(xì)胞凋亡,? 癌細(xì)胞亦可看作是凋亡失控了的細(xì)胞。,52,動物細(xì)胞數(shù)量控制的途徑,53,程序性細(xì)胞死亡對發(fā)育中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié),54,程序性細(xì)胞死亡 在形態(tài)建成中的作用,In the human foetus, the interdigital mesoderm, initially

27、formed between fingers and toes, is removed by programmed cell death.,The intestinal lumen and other tissues are sculpted by programmed cell death.,55,Male Female,Programmed cell death eliminates unwanted s

28、tructures during the development of the male and female inner reproductive organs.,56,蝌蚪向蛙發(fā)育的變態(tài)反應(yīng)中程序性細(xì)胞死亡的作用,57,植物PCD龜背竹,58,不足與過度并存：動脈粥樣硬化(內(nèi)皮凋亡過度, 平滑肌細(xì)胞增殖＞凋亡),凋亡與疾病,凋亡失調(diào),,過度：心肌缺血（缺血缺氧） 神經(jīng)元退行性疾?。ㄑ踝杂苫黾樱?,不足：腫瘤（Bcl