mTOR-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞倍體化的作用及修飾機(jī)制.pdf

1、本文分別使用nocodazole(NOCO)和佛波酯(PMA)誘導(dǎo)Dami細(xì)胞(一個(gè)巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞系)，分別建立相對(duì)同步化的多倍體化和成熟分化占優(yōu)勢(shì)的兩種細(xì)胞模型，比較可能參與細(xì)胞多倍體化細(xì)胞周期調(diào)控分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)、磷酸化狀態(tài)在這兩種細(xì)胞模型上的差別，研究雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)其調(diào)控的機(jī)制，為揭示細(xì)胞多倍性的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法：在本項(xiàng)研究中，我們分別使用nocodazole(NO

2、CO)和佛波酯(PMA)誘導(dǎo)Dami細(xì)胞，臺(tái)盼蘭拒染法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量及觀察細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、DNA倍性和表型變化；姬姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；免疫印跡分析細(xì)胞周期蛋白表達(dá)；確定建立了相對(duì)同步化的多倍體化和分化分別占優(yōu)勢(shì)的兩種細(xì)胞模型。熒光染色結(jié)合顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡觀察P-P70S6K1(Thr421/Ser424)的細(xì)胞定位；采用流式細(xì)胞儀和免疫印跡分析cyclins、CDKs、CKIs及mTOR、MAPK下游

3、相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化修飾的變化；特異性的阻斷MAPK通路檢測(cè)mTOR、MAPK下游相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化修飾的變化；以揭示細(xì)胞周期調(diào)控分子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在巨核細(xì)胞多倍體化和分化過(guò)程中所起的作用。 結(jié)果：1.NOCO抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度為50ng/ml；通過(guò)3天誘導(dǎo)后87﹪的Dami細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)拒染；多倍性細(xì)胞(≥8N)的百分比從第0天的5.3﹪±1.2﹪升至第3天的69.7﹪±10.2﹪；形態(tài)學(xué)上，第1天就觀察到Dami細(xì)胞的M期阻滯

4、，2天后觀察到少細(xì)胞質(zhì)的巨核細(xì)胞樣多倍性細(xì)胞。PMA輕微地改變了多倍性細(xì)胞的比例，從第0天的5.3﹪±1.2﹪到第3天的10.7﹪±1.4﹪；形態(tài)學(xué)顯示PMA誘導(dǎo)的多倍性細(xì)胞有更多的細(xì)胞質(zhì)。PMA上調(diào)巨核細(xì)胞標(biāo)記CD61的表達(dá)而且顯著地升高了cyclinD1的表達(dá)。2.NOCO和PMA均能誘導(dǎo)Dami細(xì)胞中cyclinB1表達(dá)，呈與二倍體相同的細(xì)胞周期分布。3.NOCO顯著地促進(jìn)4EBP1的Thr37/Thr46/Ser65位點(diǎn)、P70

5、S6K1的Thr421/Ser424位點(diǎn)的磷酸化，而PMA無(wú)此種作用。4.NOCO上調(diào)P27而PMA上調(diào)P21和cyclinD1的表達(dá)。5.P70S6K1在成熟的巨核細(xì)胞樣多倍性細(xì)胞中被磷酸化并定位于細(xì)胞質(zhì)中。6.PD98095通過(guò)對(duì)P-P70S6K1(Thr421/Ser424)和P-4EBP1(Ser65)的磷酸化顯著地升高Dami細(xì)胞的倍性；U0126減低了P-P70S6K1(Thr421/Ser424)、S6和4EBP1的磷酸化

6、，并且減低Dami細(xì)胞的倍性。 結(jié)論：1.NOCO與PMA分別誘導(dǎo)Dami細(xì)胞，成功建立了相對(duì)同步化多倍性細(xì)胞周期和成熟分化分別占優(yōu)勢(shì)的兩種細(xì)胞模型。2.P27可能與NOCO誘導(dǎo)的Dami細(xì)胞巨核細(xì)胞樣多倍體化有關(guān)；而cyclinD1和P21可能與PMA誘導(dǎo)的Dami細(xì)胞成熟分化有關(guān)。3.NOCO和PMA均能誘導(dǎo)Dami細(xì)胞中cyclinB1表達(dá)，呈與二倍體相同的細(xì)胞周期分布。cdc2的活性在NOCO誘導(dǎo)Dami細(xì)胞多倍體化的過(guò)

7、程中可能被抑制。4.在Dami細(xì)胞中，NOCO和PMA以不同的方式調(diào)節(jié)翻譯，參與細(xì)胞多倍體化和分化的調(diào)控因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是不同的。5.mTOR下游蛋白P70S6K1的Thr421/Ser424位點(diǎn)的磷酸化對(duì)巨核細(xì)胞的多倍體化是必不可少的，4EBP1的磷酸化可能與P70S6K1協(xié)同作用共同參與巨核細(xì)胞的多倍體化。6.在NOCO誘導(dǎo)的Dami細(xì)胞中，PD98095使mTOR下游蛋白P-P70S6K1(Thr421/Ser424)和P-4E