探討VEGF和PLGF對胎肝造血干細胞自我更新和分化的影響.pdf

1、背景資料：
　　 在胚胎造血發(fā)育過程中造血微環(huán)境存在一系列變遷，先后經歷了由卵黃囊(yolk sac，YS)、主動脈-性腺-中腎區(qū)(aorta gonad mesonephros，AGM)、胎肝(fetal liver，F(xiàn)L)到骨髓(bone marrow，BM)的遷移過程。在小鼠胚胎造血發(fā)育過程中，卵黃囊血島是最早的造血位點，胚胎發(fā)育7.5(E7.5)天，胚外中胚層來源的內皮和造血細胞共同組成血島，此時的造血細胞主要是原始紅系

2、細胞，并將此時的卵黃囊造血定義為“原始造血(primitive hematopoiesis)”，與之相對應的為“永久造血(definitive hematopoiesis)”。關于永久造血的發(fā)生位點目前還未明確，一般認為有兩個，分別為AGM區(qū)和YS，前者在E10天生成造血干細胞(1,2)(hematopoietic stem cell，HSC)，E11.5天后者也可生成HSC，但由于此時血循環(huán)已建立，因此不能排除卵黃囊的HSC來源于AG

3、M。
　　 卵黃囊原始造血為紅系造血，歷時短暫；之后的AGM區(qū)開始產生成體造血干細胞，而且此類細胞有多譜系分化潛能，但是，該區(qū)卻未發(fā)現(xiàn)造血分化的痕跡，因此認為AGM區(qū)為生血而非造血位點。E11天，HSC通過比較完善的血液循環(huán)遷移至胎肝；E13天時，胎肝成為主要造血場所。胎肝造血干細胞相比YS和AGM區(qū)功能更趨完善，一方面，具有很強的增殖潛能，另一方面，它可以向髓系和淋巴系分化，其中，胎肝造血微環(huán)境在造血發(fā)育中發(fā)揮了重要的調節(jié)作用

4、。胎肝具有永久重建造血的功能，因此認為其為胚胎造血的重要組成部分(3,4)。
　　 由既往研究發(fā)現(xiàn)，造血位點的遷移以及HSC增殖分化所涉及的調控基因眾多，如血管內皮生長因子(VEGF，Vascular endothelial growth factor)、BMP、Runx1、Ras、Wnt3a、Cdx和Hox等，但是機制尚未明確。VEGF家族有6個成員：VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及PLGF

5、，研究最多的為VEGF和PLGF；VEGF受體家族有三個成員，分別為flk-1、flt-1以及flt-4，前兩者主要與血管和造血發(fā)育相關，而且它們有一個共同抑制劑SU-5416，flt-4與淋巴管發(fā)育相關，非本課題研究要點。VEGF與受體flk-1和flt-1均可結合，而PLGF只與后者發(fā)生特異性結合，AKT是VEGF和PLGF信號通路中調控增殖的重要信號分子。曾有研究報道，將胚胎的VEGF或其受體基因敲除后可導致早期造血細胞發(fā)育缺陷；

6、而骨髓造血受到抑制時，利用PLGF刺激flt-1表達上調可以使造血系統(tǒng)恢復功能。在造血干細胞表面既有flk-1的表達，亦有flt-1的表達，但是關于VEGF、PLGF如何通過相應受體調控胎肝造血干細胞(FL-HSCs)自我更新和分化的研究卻很少，而二者聯(lián)合使用所起作用更是未曾發(fā)現(xiàn)報道。因此若能通過研究胎肝造血，并實現(xiàn)HSC的有效體外擴增，將為白血病、造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病疾病患者的治療帶來福音。
　　 目的：
　

7、　 胚胎造血干細胞具有很強的自我復制和增殖潛能，但是體外培養(yǎng)時仍然極易分化，因此，若能找到其增殖分化的有效調控因素，以實現(xiàn)高效、大量獲得此類細胞，將有重要意義。VEGF與受體flk-1和flt-1均可結合，而PLGF只與后者發(fā)生特異性結合。研究發(fā)現(xiàn)，將胚胎的VEGF或其受體基因敲除后可導致早期造血細胞發(fā)育缺陷，從而引起胚胎死亡，因此推測VEGF是造血發(fā)育的一個重要調控因子；而骨髓造血受到抑制時，利用PLGF刺激flt-1表達上調可以使

8、造血系統(tǒng)恢復功能，故PLGF對造血也具有一定的調控作用，但是機制均未明確。本研究主要觀察VEGF以及PLGF激活受體啟動信號通路后對FL-HSCs自我更新和分化的影響，并觀察二者作用的差異以及聯(lián)合使用時所產生的效應。
　　 方法：
　　 取E12天小鼠胚胎，利用其肝臟制備單細胞懸液，將細胞培養(yǎng)48小時后，通過MTT比色法觀察VEGF、PLGF以及二者聯(lián)合使用對胎肝造血細胞存活和增殖的影響，應用流式細胞技術來檢測造血干細胞

9、和造血祖細胞的標志物Sca-1和CD34，分析VEGF、PLGF以及二者聯(lián)合使用對干、祖細胞的支持和增殖作用，此外通過檢測細胞周期來觀察處理因素對細胞周期的影響。上述實驗分組相同，包括對照組(C組)、SU-5416組(S組)、VEGF組(V組)、PLGF組(P組)、“VEGF+PLGF”組(PV組)。通過CFU-GM(colony-forming unit-granulocyte/macrophage，粒-巨噬細胞集落形成單位)分析觀察

10、SU-5416阻斷VEGF后對造血祖細胞增殖的影響，分組如下：對照組(C組)、SU-5416組(S組)、VEGF組(V組)、“VEGF+SU-5416”組(VS組)；觀察SU-5416阻斷PLGF后對造血祖細胞增殖的影響，分組如下：對照組(C組)、SU-5416組(S組)、PLGF組(P組)、“PLGF+SU-5416”組(PS組)；觀察VEGF和PLGF共同作用對造血祖細胞增殖的影響，分組如下：對照組(C組)、SU-5416組(S組)

11、、VEGF組(V組)、PLGF組(P組)、“VEGF+PLGF”組(PV組)。計數(shù)時以肉眼可見的細胞團(含50個以上細胞)作為計數(shù)集落的標準，每組集落產量均為接種8萬個細胞所得。應用Western-Blot技術檢測VEGF、PLGF對胎肝造血干細胞增殖的調控是否通過AKT介導，分組如下：對照組(C組)、SU-5416組(S組)、VEGF組(V組)、PLGF組(P組)、“VEGF+PLGF”組(PV組)。
　　 所有數(shù)據均用mea

12、n±SD表示，用SPSS軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，*P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 集落產率如下：C組38.5±4.65，V組60±13.54，S組20.5±3.7，VS組19.75±4.5，兩兩比較，V組為S組的292％，V組為VS組的304％，VS組為S組的96.3％，經方差分析，V組與S、VS組均具有顯著性差異，而VS和S組差異無統(tǒng)計

13、學意義，因此推測VEGF能夠促進造血祖細胞得增殖，而且這個作用可被SU-5416阻斷。SU-5416亦可阻斷PLGF促進造血祖細胞增殖的作用，結果如下：C組51.667±5.96，P組80.33±8.32，S組39.5±21.95，PS組46.33±11.31，兩兩比較后，P組為S組的203％，P組為PS組的173％，PS組為S組的117％，經方差分析，P組與S、PS組均具有顯著性差異，PS組和S組差異無統(tǒng)計學意義。此外，VEGF促進造

14、血祖細胞增殖的作用大于PLGF，但是二者聯(lián)合使用卻無協(xié)同效應，結果如下：C組35.9±4.27，V組5l±5.82，S組29.6±5.46，P組39.2±7.52，PV組39.1±5.06，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，V組為P組的130％；V組為PV組的130％，P組為PV的102％，經方差分析，V組與P組間具有顯著性差異；V組與PV組間具有顯著性差異，P組與PV組差異無統(tǒng)計學意義。
　　 利用流式細胞技術所檢測表面標志的結果如下：CD34陽

15、性率分別為，C組1.97％，V組5.89％，S組2.08％，P組4.78％，PV組3.81％，兩兩比較，V組為S組的283％，P組為S組的229％，PV組為S組的183％；V組為P組的123％，V組為PV組的154％；P組為PV組的125％；
　　 Sca-1陽性率如下，C組5.22％，V組2.25％，S組1.73％，P組4.67％，PV組5.76％，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，V組為S組的130％，P組為S組的269％，PV組為S組的332

16、％；P組為V組的207％；PV組為V組的256％，PV組為P組的123％。
　　 處于S期的細胞所占百分比分別為C組7.03％，V組8.76％，S組8.38％，P組7.33％，PV組7.38％。各組差異并不明顯。
　　 通過MTT比色法分析VEGF和PLGF以及二者聯(lián)合使用對胎肝造血細胞存活和增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)VEGF可促進胎肝造血細胞的增殖，結果如下：490nm處吸光度C組為0.427±0.101，V組為0.462±

17、0.098，S組為0.398±0.141，P組為0.433±0.141，PV組為0.445±0.202，進行比較，V組為S組的118％，P組為S組的111％，PV組為S組的115％，經方差分析，V組和S組差異有統(tǒng)計學意義，其他各組組間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 將Western-Blot結果進行灰度值分析，并將各組灰度值與S組相比，結果如下C組0.628，V組1.105，S組1，P組1.158，PV組0.428，其中V組為S組的1

18、10％，P組為S組的115％，PV組為S組的42％。
　　 結論：VEGF和PLGF激活受體信號后均可促進造血細胞的體外存活和增殖分化。VEGF可促進胎肝造血祖細胞數(shù)量的擴增使CFU-GM的產率增加，并且此作用大于PLGF；PLGF則更有利于造血干細胞的體外維持和擴增。VEGF與PLGF聯(lián)合使用對胎肝造血祖細胞的擴增無協(xié)同效應；兩者聯(lián)合使用對FL-HSCs的自我更新具有協(xié)同作用。SU-5416通過阻斷flk-1和flt-1后，能