探討VEGF和PLGF對胎肝造血干細(xì)胞自我更新和分化的影響.pdf

1、背景資料：
　　 在胚胎造血發(fā)育過程中造血微環(huán)境存在一系列變遷，先后經(jīng)歷了由卵黃囊(yolk sac，YS)、主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(aorta gonad mesonephros，AGM)、胎肝(fetal liver，F(xiàn)L)到骨髓(bone marrow，BM)的遷移過程。在小鼠胚胎造血發(fā)育過程中，卵黃囊血島是最早的造血位點(diǎn)，胚胎發(fā)育7.5(E7.5)天，胚外中胚層來源的內(nèi)皮和造血細(xì)胞共同組成血島，此時(shí)的造血細(xì)胞主要是原始紅系

2、細(xì)胞，并將此時(shí)的卵黃囊造血定義為“原始造血(primitive hematopoiesis)”，與之相對應(yīng)的為“永久造血(definitive hematopoiesis)”。關(guān)于永久造血的發(fā)生位點(diǎn)目前還未明確，一般認(rèn)為有兩個(gè)，分別為AGM區(qū)和YS，前者在E10天生成造血干細(xì)胞(1,2)(hematopoietic stem cell，HSC)，E11.5天后者也可生成HSC，但由于此時(shí)血循環(huán)已建立，因此不能排除卵黃囊的HSC來源于AG

3、M。
　　 卵黃囊原始造血為紅系造血，歷時(shí)短暫；之后的AGM區(qū)開始產(chǎn)生成體造血干細(xì)胞，而且此類細(xì)胞有多譜系分化潛能，但是，該區(qū)卻未發(fā)現(xiàn)造血分化的痕跡，因此認(rèn)為AGM區(qū)為生血而非造血位點(diǎn)。E11天，HSC通過比較完善的血液循環(huán)遷移至胎肝；E13天時(shí)，胎肝成為主要造血場所。胎肝造血干細(xì)胞相比YS和AGM區(qū)功能更趨完善，一方面，具有很強(qiáng)的增殖潛能，另一方面，它可以向髓系和淋巴系分化，其中，胎肝造血微環(huán)境在造血發(fā)育中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用

4、。胎肝具有永久重建造血的功能，因此認(rèn)為其為胚胎造血的重要組成部分(3,4)。
　　 由既往研究發(fā)現(xiàn)，造血位點(diǎn)的遷移以及HSC增殖分化所涉及的調(diào)控基因眾多，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF，Vascular endothelial growth factor)、BMP、Runx1、Ras、Wnt3a、Cdx和Hox等，但是機(jī)制尚未明確。VEGF家族有6個(gè)成員：VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及PLGF

5、，研究最多的為VEGF和PLGF；VEGF受體家族有三個(gè)成員，分別為flk-1、flt-1以及flt-4，前兩者主要與血管和造血發(fā)育相關(guān)，而且它們有一個(gè)共同抑制劑SU-5416，flt-4與淋巴管發(fā)育相關(guān)，非本課題研究要點(diǎn)。VEGF與受體flk-1和flt-1均可結(jié)合，而PLGF只與后者發(fā)生特異性結(jié)合，AKT是VEGF和PLGF信號(hào)通路中調(diào)控增殖的重要信號(hào)分子。曾有研究報(bào)道，將胚胎的VEGF或其受體基因敲除后可導(dǎo)致早期造血細(xì)胞發(fā)育缺陷；

6、而骨髓造血受到抑制時(shí)，利用PLGF刺激flt-1表達(dá)上調(diào)可以使造血系統(tǒng)恢復(fù)功能。在造血干細(xì)胞表面既有flk-1的表達(dá)，亦有flt-1的表達(dá)，但是關(guān)于VEGF、PLGF如何通過相應(yīng)受體調(diào)控胎肝造血干細(xì)胞(FL-HSCs)自我更新和分化的研究卻很少，而二者聯(lián)合使用所起作用更是未曾發(fā)現(xiàn)報(bào)道。因此若能通過研究胎肝造血，并實(shí)現(xiàn)HSC的有效體外擴(kuò)增，將為白血病、造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病疾病患者的治療帶來福音。
　　 目的：
　

7、　 胚胎造血干細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我復(fù)制和增殖潛能，但是體外培養(yǎng)時(shí)仍然極易分化，因此，若能找到其增殖分化的有效調(diào)控因素，以實(shí)現(xiàn)高效、大量獲得此類細(xì)胞，將有重要意義。VEGF與受體flk-1和flt-1均可結(jié)合，而PLGF只與后者發(fā)生特異性結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，將胚胎的VEGF或其受體基因敲除后可導(dǎo)致早期造血細(xì)胞發(fā)育缺陷，從而引起胚胎死亡，因此推測VEGF是造血發(fā)育的一個(gè)重要調(diào)控因子；而骨髓造血受到抑制時(shí)，利用PLGF刺激flt-1表達(dá)上調(diào)可以使

8、造血系統(tǒng)恢復(fù)功能，故PLGF對造血也具有一定的調(diào)控作用，但是機(jī)制均未明確。本研究主要觀察VEGF以及PLGF激活受體啟動(dòng)信號(hào)通路后對FL-HSCs自我更新和分化的影響，并觀察二者作用的差異以及聯(lián)合使用時(shí)所產(chǎn)生的效應(yīng)。
　　 方法：
　　 取E12天小鼠胚胎，利用其肝臟制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，通過MTT比色法觀察VEGF、PLGF以及二者聯(lián)合使用對胎肝造血細(xì)胞存活和增殖的影響，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)來檢測造血干細(xì)胞

9、和造血祖細(xì)胞的標(biāo)志物Sca-1和CD34，分析VEGF、PLGF以及二者聯(lián)合使用對干、祖細(xì)胞的支持和增殖作用，此外通過檢測細(xì)胞周期來觀察處理因素對細(xì)胞周期的影響。上述實(shí)驗(yàn)分組相同，包括對照組(C組)、SU-5416組(S組)、VEGF組(V組)、PLGF組(P組)、“VEGF+PLGF”組(PV組)。通過CFU-GM(colony-forming unit-granulocyte/macrophage，粒-巨噬細(xì)胞集落形成單位)分析觀察

10、SU-5416阻斷VEGF后對造血祖細(xì)胞增殖的影響，分組如下：對照組(C組)、SU-5416組(S組)、VEGF組(V組)、“VEGF+SU-5416”組(VS組)；觀察SU-5416阻斷PLGF后對造血祖細(xì)胞增殖的影響，分組如下：對照組(C組)、SU-5416組(S組)、PLGF組(P組)、“PLGF+SU-5416”組(PS組)；觀察VEGF和PLGF共同作用對造血祖細(xì)胞增殖的影響，分組如下：對照組(C組)、SU-5416組(S組)

11、、VEGF組(V組)、PLGF組(P組)、“VEGF+PLGF”組(PV組)。計(jì)數(shù)時(shí)以肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)(含50個(gè)以上細(xì)胞)作為計(jì)數(shù)集落的標(biāo)準(zhǔn)，每組集落產(chǎn)量均為接種8萬個(gè)細(xì)胞所得。應(yīng)用Western-Blot技術(shù)檢測VEGF、PLGF對胎肝造血干細(xì)胞增殖的調(diào)控是否通過AKT介導(dǎo)，分組如下：對照組(C組)、SU-5416組(S組)、VEGF組(V組)、PLGF組(P組)、“VEGF+PLGF”組(PV組)。
　　 所有數(shù)據(jù)均用mea

12、n±SD表示，用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，*P＜0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 集落產(chǎn)率如下：C組38.5±4.65，V組60±13.54，S組20.5±3.7，VS組19.75±4.5，兩兩比較，V組為S組的292％，V組為VS組的304％，VS組為S組的96.3％，經(jīng)方差分析，V組與S、VS組均具有顯著性差異，而VS和S組差異無統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)意義，因此推測VEGF能夠促進(jìn)造血祖細(xì)胞得增殖，而且這個(gè)作用可被SU-5416阻斷。SU-5416亦可阻斷PLGF促進(jìn)造血祖細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果如下：C組51.667±5.96，P組80.33±8.32，S組39.5±21.95，PS組46.33±11.31，兩兩比較后，P組為S組的203％，P組為PS組的173％，PS組為S組的117％，經(jīng)方差分析，P組與S、PS組均具有顯著性差異，PS組和S組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，VEGF促進(jìn)造

14、血祖細(xì)胞增殖的作用大于PLGF，但是二者聯(lián)合使用卻無協(xié)同效應(yīng)，結(jié)果如下：C組35.9±4.27，V組5l±5.82，S組29.6±5.46，P組39.2±7.52，PV組39.1±5.06，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，V組為P組的130％；V組為PV組的130％，P組為PV的102％，經(jīng)方差分析，V組與P組間具有顯著性差異；V組與PV組間具有顯著性差異，P組與PV組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 利用流式細(xì)胞技術(shù)所檢測表面標(biāo)志的結(jié)果如下：CD34陽

15、性率分別為，C組1.97％，V組5.89％，S組2.08％，P組4.78％，PV組3.81％，兩兩比較，V組為S組的283％，P組為S組的229％，PV組為S組的183％；V組為P組的123％，V組為PV組的154％；P組為PV組的125％；
　　 Sca-1陽性率如下，C組5.22％，V組2.25％，S組1.73％，P組4.67％，PV組5.76％，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，V組為S組的130％，P組為S組的269％，PV組為S組的332

16、％；P組為V組的207％；PV組為V組的256％，PV組為P組的123％。
　　 處于S期的細(xì)胞所占百分比分別為C組7.03％，V組8.76％，S組8.38％，P組7.33％，PV組7.38％。各組差異并不明顯。
　　 通過MTT比色法分析VEGF和PLGF以及二者聯(lián)合使用對胎肝造血細(xì)胞存活和增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF可促進(jìn)胎肝造血細(xì)胞的增殖，結(jié)果如下：490nm處吸光度C組為0.427±0.101，V組為0.462±

17、0.098，S組為0.398±0.141，P組為0.433±0.141，PV組為0.445±0.202，進(jìn)行比較，V組為S組的118％，P組為S組的111％，PV組為S組的115％，經(jīng)方差分析，V組和S組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他各組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 將Western-Blot結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，并將各組灰度值與S組相比，結(jié)果如下C組0.628，V組1.105，S組1，P組1.158，PV組0.428，其中V組為S組的1

18、10％，P組為S組的115％，PV組為S組的42％。
　　 結(jié)論：VEGF和PLGF激活受體信號(hào)后均可促進(jìn)造血細(xì)胞的體外存活和增殖分化。VEGF可促進(jìn)胎肝造血祖細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò)增使CFU-GM的產(chǎn)率增加，并且此作用大于PLGF；PLGF則更有利于造血干細(xì)胞的體外維持和擴(kuò)增。VEGF與PLGF聯(lián)合使用對胎肝造血祖細(xì)胞的擴(kuò)增無協(xié)同效應(yīng)；兩者聯(lián)合使用對FL-HSCs的自我更新具有協(xié)同作用。SU-5416通過阻斷flk-1和flt-1后，能