造血干細(xì)胞移植對(duì)卵巢結(jié)構(gòu)與功能影響的研究.pdf

1、目的隨著造血干細(xì)胞移植技術(shù)(Hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT)逐步應(yīng)用于臨床，成為治療血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病和基因缺陷疾病的重要手段，HSCT治療過(guò)程中所致的醫(yī)源性損害及其防治問(wèn)題也逐漸得到重視。研究發(fā)現(xiàn)：造血干細(xì)胞移植后的女性患者可出現(xiàn)閉經(jīng)、不孕等卵巢功能衰退的表現(xiàn)，過(guò)去的研究認(rèn)為這種損害可能單純由移植前的放射治療或化學(xué)藥物預(yù)處理引起，但最近的臨床觀察發(fā)現(xiàn)其損傷還可能與免疫因素有

2、關(guān)，尤其是移植后引起的移植物抗宿主病(Graft-versus-hostdisease，GVHD)可通過(guò)激活T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，從而加重對(duì)卵巢的損害。目前有關(guān)造血干細(xì)胞移植引起卵巢損害方面的研究還不多，且多為臨床觀察性資料，而其具體機(jī)理還不十分清楚。因此，本課題通過(guò)兩部分研究來(lái)探討造血干細(xì)胞移植對(duì)卵巢結(jié)構(gòu)和功能的影響，并初步探索其發(fā)生的可能機(jī)理。第一部分通過(guò)臨床研究，即在相同化學(xué)藥物預(yù)處理?xiàng)l件下，以正常同年齡段婦女為對(duì)照，

3、觀測(cè)造血干細(xì)胞移植時(shí)不同的移植方式及移植物抗宿主病對(duì)生育年齡婦女卵巢功能的影響。鑒于醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原因，臨床上未能設(shè)立單純化學(xué)藥物預(yù)處理組作為對(duì)照，且未能取卵巢組織對(duì)移植后卵巢結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行研究，使臨床研究具有一定局限性，因此我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了第二部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過(guò)小鼠自體及同種異基因造血干細(xì)胞移植模型，觀測(cè)單純使用化學(xué)藥物預(yù)處理、自體或同種異基因造血干細(xì)胞移植后小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)及功能的變化，并用免疫組化法檢測(cè)卵巢淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況，以研究化學(xué)藥

4、物預(yù)處理、自體或同種異基因造血干細(xì)胞移植對(duì)卵巢的損害程度，并初步分析其發(fā)生的可能機(jī)理。 方法： 第一部分：臨床研究 臨床觀察45例因急性非淋巴細(xì)胞性白血病分別接受自體造血干細(xì)胞移植(Autologoushematopoieticstemcelltransplantation，Auto-HSCT)(23例)和同種異基因造血干細(xì)胞移植(Allogeneichematopoieticstemcelltransplant

5、ation，Allo-HSCT)(22例)患者的月經(jīng)情況，采用經(jīng)陰道B超監(jiān)測(cè)卵巢及子宮大小、卵泡發(fā)育情況和子宮內(nèi)膜厚度，放射免疫法檢測(cè)血清E2、P、FSH、LH、T、PRL變化。同時(shí)隨機(jī)抽取45名同年齡段健康婦女作為對(duì)照。 第二部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 以正常成年雌性BALB/C(H-2d)小鼠建立自體和同種異基因造血干細(xì)胞移植模型。實(shí)驗(yàn)分為5組(每組20只)：空白組(A組)；對(duì)照組(B組)；化學(xué)藥物預(yù)處理組(C組)；Auto-H

6、SCT組(D組)和Allo-HSCT組(E組)。每天陰道涂片檢測(cè)小鼠動(dòng)情周期，觀察移植組造血干細(xì)胞植入成功和GVHD發(fā)病情況。于預(yù)處理后15d每組隨機(jī)取10只(空白組和對(duì)照組于第2個(gè)間情期)處死，其余小鼠于預(yù)處理后30d(空白組和對(duì)照組于第4個(gè)間情期)處死，右心取血，取出子宮稱重，在光鏡和電鏡下觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)變化，放射免疫法檢測(cè)血清E2、P、FSH、LH、T、PRL水平；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)皮下組織和卵巢組織中CD3和F4/80的表

7、達(dá)，了解組織中是否有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。 結(jié)果 第一部分：臨床研究 移植組月經(jīng)情況調(diào)查結(jié)果：所有患者均在移植前化學(xué)藥物預(yù)處理后出現(xiàn)閉經(jīng)。Auto-HSCT組有4人恢復(fù)月經(jīng)，而Allo-HSCT僅有2人恢復(fù)。月經(jīng)恢復(fù)婦女的移植時(shí)年齡顯著小于持續(xù)閉經(jīng)的患者(P＜0.05)。B超下觀察卵巢和子宮發(fā)現(xiàn)：Auto-HSCT和Allo-HSCT組患者的子宮和卵巢均明顯縮小，卵泡數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜變薄。但Auto-HSCT

8、組損害顯著輕于Allo-HSCT組，(P＜0.05)；Allo-HSCT組中，發(fā)生GVHD的婦女卵巢和子宮顯著小于未發(fā)生GVHD者，發(fā)育卵泡數(shù)顯著減少，子宮內(nèi)膜更薄，(P＜0.05)。激素水平檢測(cè)顯示：移植后婦女E2、和P水平均顯著低于對(duì)照組，F(xiàn)SH、LH水平顯著增高，(P＜0.05)；Auto-HSCT組卵巢功能的損害明顯輕于Allo-HSCT，Allo-HSCT組中，伴有GVHD的患者E2、P和T水平均顯著低于無(wú)GVHD者，F(xiàn)SH水

9、平顯著高于無(wú)GVHD者，(P＜0.05)。Auto-HSCT組血清T水平與正常組間無(wú)顯著性差異，(P＞0.05)；而Allo-HSCT進(jìn)一步影響到血清T水平，使其顯著下降。各組間PRL水平無(wú)顯著性差異。 第二部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 于造血干細(xì)胞移植后第3天白細(xì)胞和紅細(xì)胞較移植前顯著上升，表明移植成功。實(shí)驗(yàn)組中，小鼠于化學(xué)藥物預(yù)處理后第1天均出現(xiàn)精神委靡、皮毛蓬松、反應(yīng)遲鈍、體重下降等表現(xiàn)。Allo-HSCT組中有14只小鼠出現(xiàn)GV

10、HD癥狀，皮膚病理檢查有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，皮下組織免疫組化檢查可見(jiàn)T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。陰道涂片檢查顯示預(yù)處理組、自體移植組和異體移植組所有小鼠均在預(yù)處理后第1天開(kāi)始陰道上皮細(xì)胞失去周期性變化。預(yù)處理組中有3只、自體移植組有4只、異體移植組僅有1只小鼠恢復(fù)動(dòng)情周期。預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT子宮重量較對(duì)照組顯著減輕，(P＜0.01)，未發(fā)生GVHD的小鼠在移植后逐漸恢復(fù)，伴有GVHD的Allo-HSCT小鼠隨病情的發(fā)展子宮

11、重量進(jìn)一步減輕。預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT組卵巢體積縮小，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后卵泡的顆粒細(xì)胞變性、壞死，卵泡數(shù)減少，閉鎖卵泡增加，間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常；伴有GVHD的小鼠卵巢組織破壞加重，其間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT組沒(méi)有發(fā)生GVHD的小鼠始基卵泡數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，其余各級(jí)卵泡如初級(jí)卵泡，次級(jí)卵泡、竇狀卵泡顯著減少，(P＜0.01)，閉鎖卵泡增加(P＜

12、0.01)。而移植后發(fā)生GVHD的小鼠各期卵泡數(shù)顯著少于未發(fā)生GVHD的小鼠，閉鎖卵泡增加，(P＜0.01)；尤其是接受Allo-HSCT后發(fā)生GVHD的30d小鼠卵泡數(shù)減少最顯著，(P＜0.01)，始基卵泡明顯受損。電鏡觀察：預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT組小鼠卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞均受到不同程度損傷，可見(jiàn)卵母細(xì)胞體積減小，周邊的顆粒細(xì)胞染色質(zhì)凝聚成塊，線粒體體積變小，顆粒細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，見(jiàn)凋亡小體，分泌現(xiàn)象消失，脂質(zhì)空

13、泡減少，但透明帶保持完整。Allo-HSCT組中伴有GVHD的小鼠卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞壞死嚴(yán)重，可見(jiàn)大量髓鞘樣結(jié)構(gòu)，30d小鼠發(fā)生GVHD者還可見(jiàn)透明帶斷裂。Allo-HSCT組中發(fā)生GVHD的15d小鼠卵巢中CD3為陽(yáng)性，表明有T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)淋巴肉芽腫；30d小鼠CD3為陽(yáng)性，其卵巢間質(zhì)中可見(jiàn)淋巴肉芽腫，并且F4/80染色陽(yáng)性，表明有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。生殖內(nèi)分泌激素水平檢測(cè)顯示：預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT組E2

14、、P較對(duì)照組顯著下降，(P＜0.01)，F(xiàn)SH、LH顯著增高，(P＜0.01)；與其他各組比較，Allo-HSCT組T水平顯著降低，(P＜0.05)；Allo-HSCT組中30d小鼠發(fā)生GVHD者血清E2、P、T水平下降最明顯，(P＜0.01；P＜0.05)。FSH、LH顯著增高，(P＜0.01)；PRL水平在各組之間無(wú)顯著性差異，(P＞0.05)。 結(jié)論 1.臨床研究發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞移植可使婦女閉經(jīng)，血清E2和P水平下降

15、，子宮及卵巢體積減小，子宮內(nèi)膜變薄，提示造血干細(xì)胞移植致卵巢功能下降，可能與卵巢結(jié)構(gòu)受損有關(guān)。 2.部分未發(fā)生GVHD的婦女移植后可自然恢復(fù)月經(jīng)。年輕者月經(jīng)較易恢復(fù)，表明移植時(shí)年齡可能是月經(jīng)恢復(fù)的影響因素之一。 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到造血干細(xì)胞移植使卵巢中發(fā)育卵泡數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)破壞，閉鎖卵泡增多，血清E2、P水平下降，證實(shí)造血干細(xì)胞移植導(dǎo)致卵巢結(jié)構(gòu)和功能受損。 4.自體和同種異基因造血干細(xì)胞移植未發(fā)生GVHD的小鼠，

16、其始基卵泡和間質(zhì)細(xì)胞未受損，部分小鼠動(dòng)情周期自行恢復(fù)，30d小鼠卵巢損傷明顯減輕，表明隨時(shí)間的延長(zhǎng)卵巢損傷可在一定程度上有所恢復(fù)，與臨床觀察結(jié)果一致。 5.自體和同種異基因造血干細(xì)胞移植未發(fā)生GVHD的小鼠其卵巢損傷的程度與單純化學(xué)藥物預(yù)處理者相同，表明其卵巢損傷的原因主要由移植前化學(xué)藥物預(yù)處理引起。 6.同種異基因造血干細(xì)胞移植后的小鼠，其卵巢結(jié)構(gòu)與功能的損害重于自體造血干細(xì)胞移植者，伴發(fā)GVHD時(shí)，卵巢組織中存在T淋