膽固醇代謝與造血干細(xì)胞的增殖分化和短時(shí)高溫致紅細(xì)胞損傷的探討.pdf

1、本論文由兩部分組成，第一部分是細(xì)胞膽固醇代謝與造血干細(xì)胞的增殖分化研究，第二部分是短時(shí)高溫致紅細(xì)胞損傷的機(jī)制研究。
　　第一部分:通過(guò)pLKO.1-NPC1/NPC2 shRNA重組慢病毒感染EML（erythroidmyeloid lymphoid，EML）細(xì)胞獲得NPC1、NPC2基因沉默的EML細(xì)胞模型，進(jìn)而探討NPC1、NPC2對(duì)EML細(xì)胞增殖分化的影響。方法通過(guò)NPC1 shRNA、NPC2 shRNA重組慢病毒感染EM

2、L細(xì)胞獲得NPC1、NPC2基因有效沉默的EML細(xì)胞模型。利用該模型以Filipin染色檢測(cè)NPC1、NPC2基因敲低后對(duì)EML細(xì)胞內(nèi)膽固醇分布的影響，以CCK-8和臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行增殖檢測(cè)，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NPC1、NPC2基因沉默后EML細(xì)胞干性標(biāo)志物CD34、sca-1、c-kit及TER-119、CD11b、B220的改變，利用Western blot分析SCF刺激細(xì)胞后c-kit磷酸化的改變。結(jié)果成功構(gòu)建NPC1、NPC2基因沉

3、默的EML細(xì)胞模型，NPC1、NPC2基因在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)。NPC1、NPC2敲低的EML細(xì)胞中出現(xiàn)膽固醇蓄積，且在NPC1敲低的EML細(xì)胞模型中膽固醇蓄積更顯著。沉默NPC1、NPC2基因后使得EML細(xì)胞增殖減慢(P＜0.01)，并且能夠降低EML細(xì)胞CD34、sca-1和TER-119、B220的陽(yáng)性率（P＜0.01）。經(jīng)SCF刺激后NPC1基因沉默的EML細(xì)胞中c-kit的磷酸化降低顯著(P＜0.

4、01)，但在NPC2基因沉默的EML細(xì)胞中c-kit磷酸化的改變并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因NPC1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇流動(dòng)參與了EML細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控。
　　造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)是機(jī)體具有組織特異性的一群細(xì)胞，為了維持正常的造血功能其可通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂（asymmetric division）在調(diào)節(jié)自身數(shù)量穩(wěn)定的同時(shí)生成多系和/或單系造血祖細(xì)胞(hematopoiet

5、ic progenitor cells，HPCs)。正常生理情況時(shí)，機(jī)體HSCs的含量和各系造血祖細(xì)胞的數(shù)量維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。當(dāng)這個(gè)穩(wěn)定平衡狀態(tài)被打破，HSCs的量急劇增多或哪一系或多系造血祖細(xì)胞數(shù)量發(fā)生顯著改變都將引發(fā)疾病。究其機(jī)制，過(guò)去大量的研究主要聚焦在免疫系統(tǒng)。近年來(lái)，有研究顯示細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出對(duì)HSCs和HPCs穩(wěn)態(tài)維持起著重要作用。三磷酸腺苷結(jié)合蛋白ABCA1和ABCG1通過(guò)把HSCs和HPCs內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至高密度

6、脂蛋白(high-densitylipoprotein，HDL)而將其運(yùn)出細(xì)胞，當(dāng)ABCA1和ABCG1缺失時(shí)上述膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑障礙，將使得造血祖細(xì)胞恢復(fù)造血功能，同時(shí)出現(xiàn)髓外造血。此外，巨核細(xì)胞祖細(xì)胞（megakaryocyte progenitor cells，MPCs）內(nèi)膽固醇外流障礙將引發(fā)血小板增多綜合征，與ABCG1高度同源的三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG4在巨核細(xì)胞祖細(xì)胞中的缺失將使得胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至HDL障礙，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞

7、膜促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)受體(c-MPL)表達(dá)增多，最終引發(fā)疾病。在動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠在體模型中載脂蛋白E(apo lipoprotein E，ApoE)通過(guò)影響ABCA1和ABCG1的功能而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出進(jìn)而調(diào)控HSCs增殖且與單核細(xì)胞增多相關(guān)。除此之外，NPC1、NPC2基因在膽固醇流出細(xì)胞的過(guò)程中同樣起著關(guān)鍵作用。NPC1基因的缺失將引發(fā)以膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)障礙為特征的尼曼匹克病(NPC1)，患者主要

8、表現(xiàn)為神經(jīng)元的大量膽固醇聚集和神經(jīng)功能障礙，同時(shí)患者也存在造血功能障礙，但是機(jī)制不清楚，還需要探討。
　　為了探索NPC1、NPC2基因調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞生物學(xué)特性，特別是增殖和分化特征，本課題以造血干細(xì)胞系EML（erythroid myeloid lymphoid）作為模型，通過(guò)基因表達(dá)分析、基因功能分析研究NPC1、NPC2基因?qū)ML細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控及其機(jī)制。
　　首先我們根據(jù)EML細(xì)胞干性標(biāo)志sca-1不同水平的表

9、達(dá)，通過(guò)細(xì)胞流式技術(shù)分離sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low3個(gè)細(xì)胞亞群，檢測(cè)各亞群細(xì)胞中NPC1和NPC2基因的表達(dá)，分析NPC1、NPC2基因表達(dá)與EML細(xì)胞干性的關(guān)聯(lián)。其次，通過(guò)基因沉默技術(shù)敲降(knock-down) EML細(xì)胞NPC1和NPC2基因，分析NPC1和NPC2對(duì)EML細(xì)胞增殖和分化的影響。最后，通過(guò)分析NPC1和NPC2基因?qū)CF介導(dǎo)c-kit磷酸化的影響，探討NPC1和NPC2調(diào)節(jié)細(xì)

10、胞增殖分化的機(jī)制。
　　本研究得到的主要結(jié)果有:
　　在EML細(xì)胞中NPC1和NPC2基因的表達(dá)與sca-1呈正相關(guān)。
　　利用NPC1、NPC2基因慢病毒成功構(gòu)建了NPC1、NPC2基因敲低的EML細(xì)胞模型。Filipin染色結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，在NPC1和NPC2基因沉默的EML細(xì)胞中膽固醇顯著蓄積，且NPC1基因沉默的EML細(xì)胞中膽固醇蓄積更顯著。
　　NPC1、NPC2基因沉默的EML細(xì)胞生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)

11、照細(xì)胞(P＜0.01)，表明NPC1和NPC2基因參與了EML細(xì)胞的增殖調(diào)控。同時(shí)，NPC1、NPC2基因沉默的EML細(xì)胞CD34和sca-1的陽(yáng)性率顯著降低(P＜0.01)，提示NPC1、NPC2沉默以后能夠使EML細(xì)胞的分化能力降低。
　　在幾種細(xì)胞中粒系標(biāo)志物CD11b所占比例均較低，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明NPC1、NPC2基因敲低后對(duì)EML細(xì)胞向粒系的分化并無(wú)影響;而在NPC1沉默的EML細(xì)胞中TER-119所占比例顯著

12、低于其余3種細(xì)胞(P＜0.01)，說(shuō)明NPC1基因的沉默能夠抑制EML細(xì)胞向紅系分化;B220所占比例在NPC1、NPC2基因沉默的EML細(xì)胞中顯著降低(P＜0.01)，表明沉默NPC1、NPC2基因能夠抑制EML細(xì)胞向淋巴系分化。
　　SCF刺激細(xì)胞后，NPC1基因沉默的EML細(xì)胞c-kit磷酸化受到明顯抑制(P＜0.01)，但在NPC2基因沉默的EML細(xì)胞中c-kit的磷酸化改變并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示，NPC1基因參與了EML細(xì)

13、胞c-kit的磷酸化調(diào)控。
　　利用細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑U18666A、細(xì)胞膜膽固醇剝離劑beta-CD、游離膽固醇處理EML細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)U18666A、beta-CD處理后EML細(xì)胞c-kit的磷酸化顯著降低(P＜0.01)，與NPC1基因沉默對(duì)c-kit磷酸化的影響一致;并且，當(dāng)聯(lián)合使用beta-CD和膽固醇處理后相較于前者，EML細(xì)胞c-kit的磷酸化有所升高（P＜0.01），提示NPC1對(duì)SCF介導(dǎo)的EML細(xì)胞c-kit

14、磷酸化的影響是通過(guò)改變細(xì)胞膜膽固醇含量實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分:紅細(xì)胞(Red blood cells，RBC)是哺乳動(dòng)物血液中數(shù)量最多的血細(xì)胞，RBCs除了是氧氣運(yùn)輸?shù)闹饕浇檫€是重要的免疫細(xì)胞。RBCs生成于骨髓，在體內(nèi)，新生的RBCs平均壽命為120d，并將經(jīng)歷輕齡、中齡、老齡3個(gè)階段，最終衰老的RBCs被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，或是在經(jīng)過(guò)肝臟時(shí)被枯否細(xì)胞（Kupffer Cells）分解為膽汁。但在病理狀態(tài)下RBCs的衰老死亡將加

15、劇。細(xì)胞生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高溫能夠引起細(xì)胞質(zhì)膜變形，形成凸起狀泡。在一定程度上，泡的形成是自適應(yīng)的，從而增加細(xì)胞的存活率。但是細(xì)胞受熱越嚴(yán)重起泡程度越大，并且細(xì)胞死亡率越高。廣泛的數(shù)據(jù)顯示，高熱、熱射病時(shí)體溫升高治療不及時(shí)或治療不完善將導(dǎo)致紅細(xì)胞減少甚至貧血，但究其機(jī)制還尚不清楚，亟待進(jìn)一步研究。
　　為了觀察短時(shí)高溫引起紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化，探討高熱（中暑）引起紅細(xì)胞損傷的機(jī)制。本研究取健康志愿者的靜脈血，分別在37℃（對(duì)照組）

16、和42℃（實(shí)驗(yàn)組）下孵育10 min，Percoll密度梯度離心法分離不同細(xì)胞年齡的紅細(xì)胞，測(cè)定其Zeta電位值，分析不同年齡紅細(xì)胞所占比例的改變;同時(shí)，我們利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞大小、細(xì)胞凋亡以及紅細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的變化，探討高溫對(duì)紅細(xì)胞衰老、凋亡的影響。
　　本研究得到的主要結(jié)果有:
　　與37℃相比，42℃下實(shí)驗(yàn)組的紅細(xì)胞表面電荷顯著降低(P＜0.05)，紅細(xì)胞體積顯著減小(P＜0.05)，凋亡顯著增加(P＜0.