高原低氧環(huán)境對(duì)骨髓造血干細(xì)胞增殖與定向選擇分化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：長(zhǎng)期高原低氧環(huán)境生活會(huì)代償性的引起機(jī)體紅細(xì)胞生成增多。過(guò)度的紅細(xì)胞生成會(huì)導(dǎo)致血液粘度增高，微循環(huán)阻力增加，加重組織細(xì)胞缺氧，并可引起一系列臨床癥狀。既往研究雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了低氧刺激機(jī)體生成高水平的促紅細(xì)胞生成素(EPO)是高原紅細(xì)胞增多的重要發(fā)生機(jī)制，但通過(guò)對(duì)高原生活人群的觀察發(fā)現(xiàn)EPO的水平與紅細(xì)胞的增生程度常常并不相關(guān)，提示存在非EPO途徑和機(jī)制。
　　 在成年機(jī)體，包括紅細(xì)胞在內(nèi)的所有類型成熟血細(xì)胞均起源于造血干細(xì)胞。

2、研究發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞參與了失血、感染等應(yīng)激情況下的紅細(xì)胞、白細(xì)胞生成過(guò)程，因此我們推測(cè)造血干細(xì)胞可能對(duì)高原低氧環(huán)境發(fā)生反應(yīng)并在高原紅細(xì)胞增生的過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本課題針對(duì)這一問(wèn)題展開研究。
　　 方法：以模擬海拔6000m低氧環(huán)境暴露小鼠為模型，觀察高原低氧環(huán)境暴露0，1，3，7，14，28天對(duì)骨髓與脾臟Lineage-Sea-1+c-Kit+(LSK)表型造血干細(xì)胞的數(shù)量、增殖狀況與定向分化系選擇性的影響。在此基礎(chǔ)上，將正常小

3、鼠的骨髓LSK細(xì)胞置于不同的EPO濃度、不同的氧濃度下進(jìn)行培養(yǎng)，或在培養(yǎng)體系中分別加入常氧和低氧暴露小鼠的骨髓培養(yǎng)上清，觀察培養(yǎng)后Sca-1+造血干細(xì)胞的增殖情況與定向分化潛能，以探討機(jī)體高原低氧暴露時(shí)調(diào)控造血干細(xì)胞反應(yīng)的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果：暴露于模擬海拔6000m低氧環(huán)境的小鼠骨髓和脾臟中l(wèi)ineage-Sca-1+c-Kit+(LSK)表型造血干細(xì)胞數(shù)量均顯著擴(kuò)增，增加的造血干細(xì)胞既包括通常處于活躍細(xì)胞周期的短期重建造血

4、能力造血干細(xì)胞(CD34+LSK細(xì)胞)，也包括通常維持靜息狀態(tài)的長(zhǎng)期重建造血能力造血干細(xì)胞(CD34-LSK細(xì)胞)，低氧暴露時(shí)，骨髓和脾臟CD34+LSK細(xì)胞與CD34-LSK細(xì)胞的增殖率(BrdU摻入率)均顯著增高，但細(xì)胞凋亡率無(wú)改變。
　　 在小鼠低氧暴露的28天時(shí)間范圍內(nèi)，骨髓LSK造血干細(xì)胞在第3-28天呈現(xiàn)持續(xù)性的增殖，而脾臟造血干細(xì)胞只在第3-14天呈現(xiàn)暫時(shí)性的增殖，到第28天回落到低氧暴露前水平，即骨髓造血干細(xì)胞的

5、變化時(shí)相性更符合高原紅細(xì)胞長(zhǎng)期慢性增多過(guò)程特點(diǎn)。另外，小鼠全身骨髓造血干細(xì)胞總數(shù)量約為脾臟造血干細(xì)胞的10倍，因此骨髓造血干細(xì)胞的增殖對(duì)高原紅細(xì)胞增多可能發(fā)揮更大的作用。
　　 通過(guò)對(duì)骨髓早期定向祖細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，在巨核-紅系祖細(xì)胞(MEP)數(shù)量隨著機(jī)體低氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)不斷增多的同時(shí)，粒-單核祖細(xì)胞(GMP)數(shù)量在低氧暴露7-14天時(shí)出現(xiàn)暫時(shí)性的下降，通過(guò)觀察排除了增殖和凋亡情況改變導(dǎo)致GMP減少的可能性，提示上游造血干細(xì)胞定向

6、分化系選擇性的變化導(dǎo)致了GMP的減少。對(duì)骨髓LSK造血干細(xì)胞紅系和粒-單系定向分化潛能的直接觀察結(jié)果證實(shí)了上述推測(cè)。一是低氧暴露小鼠骨髓LSK細(xì)胞紅系特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的表達(dá)量增高，對(duì)應(yīng)粒-單系特異性轉(zhuǎn)錄因子PU.1的表達(dá)量降低；二是低氧暴露小鼠的骨髓LSK細(xì)胞在體外半固體培養(yǎng)基上能形成較多比例的BFU-E紅系集落和較少比例的CFU-GM粒巨噬系集落；三是低氧暴露小鼠的骨髓LSK細(xì)胞經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后能形成更多的Ter119+

7、紅系前體細(xì)胞。
　　 通過(guò)將正常小鼠的骨髓LSK細(xì)胞在不同的EPO濃度、不同的O2濃度、或分別在培養(yǎng)體系中加入常氧與低氧暴露小鼠的骨髓培養(yǎng)上清進(jìn)行培養(yǎng)得到以下結(jié)果：
　　 第一、EPO水平的升高不影響培養(yǎng)后Sca-1+造血干細(xì)胞的增殖與紅系定向分化潛能。
　　 第二、現(xiàn)有研究認(rèn)為正常生理?xiàng)l件時(shí)骨髓多數(shù)造血干細(xì)胞的居留環(huán)境氧分壓約相當(dāng)于5％O2濃度，此氧分壓可能隨外界低氧環(huán)境進(jìn)一步降低，但未觀察到比5％O2更低的氧

8、分壓(2％O2)能促進(jìn)培養(yǎng)后Sca-1+造血干細(xì)胞的增殖和紅系定向分化潛能。
　　 第三、將低氧暴露小鼠的骨髓培養(yǎng)上清加入LSK細(xì)胞培養(yǎng)體系可以顯著促進(jìn)培養(yǎng)后Sca-1+造血干細(xì)胞的增殖和紅系定向分化潛能，通過(guò)抗體中和實(shí)驗(yàn)證明了低氧暴露后骨髓微環(huán)境中分泌增多的白介素3和白介素6參與了對(duì)造血干細(xì)胞的擴(kuò)增作用，白介素3還參與了促進(jìn)造血干細(xì)胞紅系定向分化潛能。
　　 結(jié)論：高原低氧環(huán)境下，一方面，骨髓造血干細(xì)胞通過(guò)增殖從數(shù)量上