Nanog在胚胎干細(xì)胞自我更新中的作用機(jī)制研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryomc stem eells，ES cells)是一群具有多向分化潛能的細(xì)胞，發(fā)育上的全能性賦予其在臨床上廣泛的應(yīng)用前景。對(duì)胚胎干細(xì)胞全能性機(jī)制的研究是其在臨床上得以應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。Nanog是2003年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，特異性的表達(dá)于全能性細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)Nanog在胚胎干細(xì)胞的全能性維持、早期分化以及成體細(xì)胞的去分化過程中起至關(guān)重要的作用，但是其具體的作用機(jī)制現(xiàn)在仍未闡明。本研究旨在通過研究Nanog的下

2、游靶基因、上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控、以及其是否參與成體細(xì)胞的去分化過程來闡明Nanog在胚胎干細(xì)胞自我更新中的作用機(jī)制。 本研究的第一部分旨在研究胚胎干細(xì)胞中受Nanog表達(dá)調(diào)控的相關(guān)基因。Nanog作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游基因的表達(dá)來發(fā)揮作用，對(duì)這些基因的分析研究能夠更好地了解Nanog在胚胎干細(xì)胞中的作用機(jī)制。我們采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)的方法特異性的降低胚胎干細(xì)胞中Nanog的表達(dá)，為了

3、得到有效的干擾片斷，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了四個(gè)特異性的Nanog干擾片斷以及一個(gè)陰性對(duì)照片斷。從中篩選得到一個(gè)高效的干擾片斷Nanog-siRNA-P1，Westerm-Blot和Rea1-Time PCR分析結(jié)果顯示Nanog-siRNA-P1對(duì)Nanog表達(dá)的抑制效率可達(dá)90％。Naaog表達(dá)降低后，胚胎干細(xì)胞呈現(xiàn)分化特征，并伴隨著細(xì)胞增殖能力下降。在用RNA干擾方法沉默Nanog表達(dá)24h和48h后，采用表達(dá)譜芯片篩選變化基因。我們認(rèn)為這

4、些差異表達(dá)基因?yàn)镹anog的相關(guān)下游靶基因，對(duì)這些基因的進(jìn)一步研究分析將有助于我們了解Nanog在ES細(xì)胞全能性維持中的作用機(jī)制。 在本研究的第二部分中，我們觀察了P13K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)胚胎干細(xì)胞自我更新能力以及Nanog表達(dá)的影響。首先，我們觀察到利用P13K信號(hào)通路特異性的抑制劑LY294002特異性地抑制P13K通路的激活后，ES細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的分化狀態(tài)，Nanog表達(dá)下降．為了了解P13K信號(hào)通路在ES細(xì)胞自我更新中的作用

5、是否是通過調(diào)節(jié)Nanog的表達(dá)介導(dǎo)的，我們構(gòu)建了Nanog-GFP融合蛋白表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，G418篩選后得到過表達(dá)Nanog的ES細(xì)胞(Ex-Nanog-J1)。結(jié)果表明Nanog的過表達(dá)可以使小鼠的ES細(xì)胞在無LIF條件下保持不分化狀態(tài)，并可以減弱由于LY294002所引起的ES細(xì)胞分化，但是外源性的Nanog并不能完全逆轉(zhuǎn)這一分化作用。 本研究的第三部分中我們觀察了Nanog在成體細(xì)胞去分化中的作用。大家都知道胚胎

6、干細(xì)胞可以在適宜的條件下向三個(gè)胚層的各種組織細(xì)胞分化，成體細(xì)胞也可以通過細(xì)胞融合(cell fusion)以及成體細(xì)胞核移植(somatic cells nucleartransfer,SCNT)的方法去分化到多能性干細(xì)胞階段。Nanog特異性的表達(dá)于胚胎干細(xì)胞中，并且在胚胎干細(xì)胞的多能性維持中也起重要作用，那么，Nanog是否參與成體細(xì)胞的去分化過程呢?為了研究Nanog在成體細(xì)胞去分化中的作用，我們構(gòu)建了Nanog-GFP融合蛋白表

7、達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，G418篩選得到表達(dá)Nanog的3T3細(xì)胞，觀察到外源性Nanog特異性的表達(dá)于3T3細(xì)胞的細(xì)胞核中，這與Nanog在胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)定位相同。繼而我們觀察了表達(dá)Nanog的3T3細(xì)胞是否向著全能性細(xì)胞轉(zhuǎn)化，鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)并沒有顯著的變化，細(xì)胞周期檢測(cè)Nanog可以提高3T3細(xì)胞的S期降低G0/G1期和M期，可以激活Oct4的表達(dá)，但是卻未檢測(cè)到其它的ES細(xì)胞相關(guān)基因Sox2、Utfl、Ets2的表達(dá)。這

8、些表明Nanog在成體細(xì)胞去分化過程中，可能會(huì)起一定的作用，但是單純的Nanog過表達(dá)并不足以使成體細(xì)胞去分化到全能性細(xì)胞階段。 通過該項(xiàng)研究我們發(fā)現(xiàn)：Nanog在胚胎干細(xì)胞的自我更新過程中起至關(guān)重要的作用，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Nanog通過促進(jìn)全能性相關(guān)基因的表達(dá)以及抑制分化相關(guān)基因的表達(dá)來維持ES細(xì)胞的不分化狀態(tài)；P13K信號(hào)通路參與胚胎干細(xì)胞全能性的維持，利用LY294002(P13K通路特異性的抑制劑)抑制P13K通路后誘導(dǎo)