Tfcp2l1促進小鼠胚胎干細胞自我更新的機制研究.pdf

1、哺乳動物的發(fā)育起始于精子(sperm)與卵子(oocyte)的結合，兩者形成受精卵(zygote)后啟動發(fā)育程序，此后受精卵會經歷一系列的卵裂(cleavage)，細胞數(shù)量不斷增多，細胞功能形態(tài)差異化。1981年由Evans和Kaufman從小鼠著床前囊胚內細胞團中成功分離了小鼠的胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)，由此建立了最早的胚胎干細胞系。之后人們又陸續(xù)分離了人、大鼠等的胚胎干細胞。由于

2、胚胎干細胞具有自我更新和多向分化的生物學特性，所以無論是在生物發(fā)育研究方面還是臨床醫(yī)學應用方面都具有非常重要的研究價值。經過前人的大量工作，現(xiàn)在人們已經找到能夠在體外長期維持部分胚胎干細胞自我更新狀態(tài)的方法。但是由于胚胎干細胞維持自我更新是一個極其復雜的生物學過程，因此全面深入的研究胚胎干細胞維持自我更新及分化的調控機制，有利于其廣泛而安全的應用。
　　目前體外培養(yǎng)胚胎干細胞的培養(yǎng)基主要有兩種:一種是LIF/serum培養(yǎng)基;一種

3、是無血清的2i/N2B27培養(yǎng)基:在N2B27中添加CHIR和PD03兩種小分子抑制劑(2i)。這兩種培養(yǎng)基通過不同的信號通路維持胚胎干細胞的自我更新，LIF/serum主要是通過LIF/STAT3信號通路。本課題組成員之前的研究發(fā)現(xiàn):在眾多的LIF/STAT3信號通路的靶基因中，Tfcp2l1是唯一下調之后導致LIF/serum培養(yǎng)條件下的小鼠胚胎干細胞出現(xiàn)分化的基因。這說明了在LIF/STAT3信號通路促進mESCs自我更新的過程中

4、Tfcp2l1占有極其重要的位置。并且人們后來又發(fā)現(xiàn)同時過表達Tfcp2l1和klf2可以替代2i維持小鼠胚胎干細胞的未分化狀態(tài)，所以Tfcp2l1作為多條通路的共同靶基因扮演了十分特殊的角色，但是Tfcp2l1作用的具體機制還不是很清楚。
　　為了探究Tfcp2l1在mESCs中調控自我更新的具體機制，我們首先在細胞中下調Tfcp2l1的表達量，檢測各個胚層的基因表達，查看其影響了向哪些胚層的分化。結果發(fā)現(xiàn)內胚層(endoder

5、m)、中胚層（mesoderm）和滋養(yǎng)層（trophectoderm）的基因發(fā)生了明顯的上調。為了反向驗證這個結果，我們使用可經DOX誘導過表達Tfcp2l1的細胞株i-Tfcp2l1進行了擬胚體(EB)分化，結果顯示:在EB形成過程中，誘導Tfcp2l1的表達可以抑制mESCs向內胚層、中胚層和滋養(yǎng)層方向分化。這些研究結果表明Tfcp2l1抑制mESCs向中內胚層以及滋養(yǎng)層細胞方向分化。
　　TFCP2L1蛋白結構是其發(fā)揮作用的

6、基礎，于是我們通過實驗分析了TFCP2L1蛋白不同結構域在維持mESCs自我更新方面的作用。首先我們在前人研究的基礎上把TFCP2L1蛋白劃分成了四個結構域:N-terminus(aa1-20)、CP2-like domain(aa21-242)、SAM domain(aa310-376)和C-terminus(aa377-480)。我們把這些片段一一缺失，構建了四個過表達缺失突變蛋白的mESCs細胞株(△NT、△CP2、△SAM、△C

7、T)進行分化實驗。結果顯示△NT和△CP2細胞株不能在無LIF條件下維持自我更新。緊接著我們也進行了mEpiSCs（mouse epiblast stem cells，mEpiSCs）重編程回到na(i)ve多能性狀態(tài)的實驗。發(fā)現(xiàn)△NT和△CP2突變體不能或極少的使mEpiSCs重編程回na(i)ve狀態(tài)。以上實驗結果說明了N-terminus和CP2-like domain對于Tfcp2l1維持mESCs的na(i)ve多能性非常重要

8、。
　　我們在培養(yǎng)缺失突變細胞株的過程中發(fā)現(xiàn)△NT和△CP2細胞株在正常LIF/serum培養(yǎng)條件下出現(xiàn)了微分化，進一步的qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)△CP2細胞株存在比較高的內胚層基因（Gata4和Gata6）的表達;△NT細胞株則表達了較高的中胚層（T和Mixl）和滋養(yǎng)層的基因(Cdx2和Gata3)。于是我們便尋找導致細胞分化的原因，借以探究Tfcp2l1抑制mESCs向中胚層和滋養(yǎng)層分化的機制。經過一系列的實驗我們證明了△NT細

9、胞株向中胚層和滋養(yǎng)層方向分化是由Lef1上調表達引起的，即Tfcp2l1通過抑制Lef1的表達來抑制中胚層和滋養(yǎng)層基因的出現(xiàn)。
　　那么Tfcp2l1對于內胚層基因的調節(jié)又是通過怎樣的途徑呢，我們查找資料后發(fā)現(xiàn)，MTA家族基因或許起著非常重要的作用。我們通過實驗發(fā)現(xiàn)MTA家族基因中只有Mta1的下調可以導致過表達Tfcp2l1的mESCs分化，并且是向內胚層方向分化。反之，過表達Mta1能夠延緩mESCs分化。免疫共沉淀進一步證明