Id2促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制研究.pdf

1、小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)是從早期囊胚中的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)細(xì)胞分離而得到的。在適宜的體外培養(yǎng)個(gè)條件下，能夠無限制的進(jìn)行自我復(fù)制式的增值即自我更新，通過合適的誘導(dǎo)條件還能夠分化成來源于內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的各種類型細(xì)胞的能力，即多項(xiàng)分化的潛能[1-3]。由于小鼠胚胎干細(xì)胞具有的這些特性，使其成為研究發(fā)育生物學(xué)的理想原材料和疾病模型構(gòu)建的重要材料。因此，

2、具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。早期分離得到的小鼠胚胎干細(xì)胞需要培養(yǎng)在滅活的飼養(yǎng)層細(xì)胞（Mouse embryonicfibroblasts，MEFs）上，并添加含胎牛血清的培養(yǎng)基[1]。對(duì)于胚胎干細(xì)胞的研究，其中一個(gè)重要的內(nèi)容就是在體外培養(yǎng)的條件下如何去維持其處在多能性的狀態(tài)。經(jīng)過大量研究人員的不斷探索目前已經(jīng)建立起了LIF/血清(FBS)培養(yǎng)體系，無血清的N2B27培養(yǎng)體系以及2i[3]培養(yǎng)體系等適合不同胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系。研究胚胎

3、干細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下如何能夠維持在自我更新的狀態(tài)而不分化，就要對(duì)其維持自我更新的分子機(jī)制進(jìn)行研究。經(jīng)過研究人員的不懈努力，已經(jīng)篩選和鑒定出了一些維持小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因[4]如:Tfcp2l1，Nanog, Esrrb，Sox2等，信號(hào)通路如:LIF/STAT3，WNT/β-catenin等。雖然這些信號(hào)通路和基因已經(jīng)篩選出來，但是胚胎干細(xì)胞的調(diào)節(jié)是各種基因和信號(hào)通路相互作用的復(fù)雜過程。目前對(duì)于胚胎干細(xì)胞如何維持自我

4、更新而不出現(xiàn)分化的分子機(jī)制仍然不清楚。因此，需要將細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)以及分子生物學(xué)相結(jié)合，進(jìn)一步對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行研究，探究其自我更新和分化的調(diào)節(jié)機(jī)制[5]。
　　前期已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，Id基因家族的成員在無血清的N2B27培養(yǎng)條件下是BMP4/SMAD信號(hào)通路的下游基因，過表達(dá)后可以部分的代替BMP4的作用來維持小鼠胚胎干細(xì)胞的干性[6]。但是，Id基因家族維持mESCs自我更新的機(jī)制仍然不清楚。先前有文獻(xiàn)報(bào)道Id1基因在含血清的培養(yǎng)

5、基中能夠部分的代替LIF的作用，通過上調(diào)Nanog基因的表達(dá)來維持mESCs的自我更新，同時(shí)對(duì)于中胚層的標(biāo)志基因T的表達(dá)也具有一定的抑制作用[7]。但是，對(duì)于Id基因家族的另外兩個(gè)成員Id2，Id3在mESCs中所發(fā)揮的作用并沒有報(bào)道。因此，本課題主要研究Id2和Id3在mESCs的作用。Id家族表達(dá)的蛋白具有螺旋-環(huán)，螺旋(helix-loop-helix，HLH)結(jié)構(gòu)域，對(duì)于細(xì)胞的遷移與周期發(fā)生具有促進(jìn)的作用，同時(shí)又能夠抑制多種前體

6、的分化，延緩細(xì)胞的衰老[8]。因此，其對(duì)于胚胎干細(xì)胞干性的維持可能具有一定的作用。
　　為了研究Id2和Id3這兩個(gè)基因在mESCs中的作用，我們首先過表達(dá)這兩個(gè)基因，利用相關(guān)的生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)引物并大量擴(kuò)增所需要的基因片段。驗(yàn)證結(jié)果正確后，借助脂質(zhì)體的特性將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到mESCs中。經(jīng)過篩選與驗(yàn)證，確定正確的能夠穩(wěn)定遺傳的過表達(dá)細(xì)胞系。我們將建立的過表達(dá)細(xì)胞系培養(yǎng)在不含有LIF的血清培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)。一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的細(xì)胞

7、株仍然具有胚胎干細(xì)胞的形態(tài)，而對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)死亡或者已經(jīng)分化。接著我們對(duì)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志性基因（如:Nanog、Oct4、Esrrb、Tfcp2l1等）進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示:過表達(dá)Id2或者Id3的細(xì)胞系Nanog和Oct4的免疫熒光呈陽性，且多能性的標(biāo)志堿性磷酸酶染色(AP)也成陽性，而對(duì)照組均為陰性。通過對(duì)檢測結(jié)果的分析，過表達(dá)后的細(xì)胞仍然維持在多能性的狀態(tài)，而且Id2過表達(dá)的細(xì)胞與Id3過表達(dá)的細(xì)胞相比，產(chǎn)生更多的AP陽性克隆，說明

8、其促進(jìn)自我更新的作用優(yōu)于Id3。因此，我們后續(xù)主要對(duì)Id2基因進(jìn)行研究。接著我們通過shRNA的方法下調(diào)Id2基因的表達(dá)。結(jié)果顯示:下調(diào)后的細(xì)胞出現(xiàn)了分化，不能維持胚胎干細(xì)胞的形態(tài)，說明Id2對(duì)mESCs干性的維持是非常重要的。隨后，我們使用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選Id2調(diào)控的下游靶基因。測序結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行比較，有許多基因的表達(dá)量發(fā)生了變化。通過進(jìn)一步的篩選，我們發(fā)現(xiàn)與胚胎干細(xì)胞多能性維持具有相關(guān)作用的c-Myc和n-Myc這兩

9、個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)上調(diào)。接著我們通過在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與測序一致。最后，我們對(duì)經(jīng)過分析后所選擇的靶基因進(jìn)行功能性驗(yàn)證。在過表達(dá)Id2的細(xì)胞系中，下調(diào)c-Myc和n-Myc的表達(dá)，結(jié)果顯示:下調(diào)后胚胎干細(xì)胞出現(xiàn)了分化。在下調(diào)Id2表達(dá)的細(xì)胞系中，分別過表達(dá)c-Myc和n-Myc，結(jié)果顯示:過表達(dá)c-Myc和n-Myc后能夠?qū)ο抡{(diào)Id2后導(dǎo)致的細(xì)胞分化具有一定的削弱作用。
　　綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，過表