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文檔簡介
1、目的研究5種蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)亞型PKC alpha(α)、PKCbeta(β)、PKC gamma(γ)、PKC delta(δ)和PKC epsilon(ε)在小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES細(xì)胞)株ES-D3細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞過程中的時空表達(dá)變化,探討PKC信號對ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化中發(fā)育基因(pax-6、slit-2、netrin-1)表達(dá)的影響,試圖發(fā)
2、現(xiàn)PKC調(diào)控ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的分子機(jī)制.方法ES-D3細(xì)胞株用普通ES細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),應(yīng)用經(jīng)典的4-/4+法,經(jīng)胚胎體(embryoid bodies,EBs)階段后,用5×10<'-7>M維甲酸(retinoic acid,RA)誘導(dǎo),用NSE和NF-200來鑒定分化細(xì)胞的類型,在誘導(dǎo)后第4天用免疫組織化學(xué),在誘導(dǎo)后第1、3、5、7和14天用Western印跡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)方法來檢測PKC亞型的表達(dá)變化;用
3、RT-PCR方法測定細(xì)胞的發(fā)育基因的mRNA表達(dá)情況,并觀察了PKC激活劑佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和抑制劑D-鞘氨醇對它們表達(dá)的影響.將PKCα cDNA正義和反義真核表達(dá)載體質(zhì)粒,應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectin轉(zhuǎn)染ES-D3細(xì)胞,經(jīng)Western印跡等檢驗(yàn),成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)和表達(dá)反義PKCα的ES-D3細(xì)胞模型,觀察PKCα亞類對發(fā)育基因表達(dá)的影響.結(jié)論(1)PKC<,α>、
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