PI3Kp110β參與調(diào)控人胚胎干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的研究.pdf

1、背景和目的：
　　目前1型糖尿病和部分2型糖尿病患者仍需終身依賴外源性胰島素治療，且不能改善遠(yuǎn)期并發(fā)癥。近年胰島器官移植的成功提示了胰島細(xì)胞可以彌補(bǔ)胰腺細(xì)胞的不足而用于治療糖尿病，但供體的嚴(yán)重不足限制了其在臨床的應(yīng)用。而移植由人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的胰島素分泌細(xì)胞可能有助于解決供體不足的問題。至目前為止，大多數(shù)誘導(dǎo)分化方案獲得的胰島樣細(xì)胞共表達(dá)胰高血糖素和/或生長抑素，仍不是功能完善的β細(xì)胞。在我們前期研究中，在末階段添加外源性

2、誘導(dǎo)因子Exendin-4得到C肽陽性細(xì)胞率高達(dá)90％，大大提高了胚胎干細(xì)胞的分化效率，但其共表達(dá)四種胰腺特異蛋白，屬于不成熟的胰島前體細(xì)胞。
　　Hori等在鼠胚胎干細(xì)胞分化末階段采用PI3K抑制劑 LY294002成功獲得95%-97%的胰島素陽性細(xì)胞，僅有2%-3%的胰高血糖素陽性細(xì)胞。但其干細(xì)胞來源于小鼠，且在培養(yǎng)中使用了血清培養(yǎng)基，這些動(dòng)物源性因素限制了分化細(xì)胞的臨床應(yīng)用。PI3K分為四個(gè)亞型，被廣泛研究的IA類PI3K

3、主要由p110催化亞基（p110α，β，δ）和p85調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成的異源二聚體組成。然而究竟是何種構(gòu)型的PI3K異二聚體參與人胚胎干細(xì)胞的定向分化還未見有所報(bào)導(dǎo)。因此，本實(shí)驗(yàn)嘗試在無血清培養(yǎng)條件下，在誘導(dǎo)末階段采用PI3K抑制劑LY294002誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化，以期獲得更加成熟的胰島素分泌細(xì)胞；采用PI3KP110β抑制劑TGX-221初步探索PI3Kp110β對人胚胎干細(xì)胞定向分化的影響。
　　材料和方法：
　　1.

4、人胚胎干細(xì)胞單克隆細(xì)胞系 PKU1.1由北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心陳貴安教授贈(zèng)送。采用“五步誘導(dǎo)法”包括：人胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)（HES階段）；擬胚體的形成（EB階段）；通過ITSF液篩選巢蛋白陽性細(xì)胞（ITS階段）；添加B27、N2以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）擴(kuò)增巢蛋白陽性細(xì)胞（N2階段）；去除 bFGF，添加廣譜的PI3K抑制劑LY294002誘導(dǎo)因子為實(shí)驗(yàn)組，

5、添加前期研究采用的Exendin-4因子為對照組分別誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞的定向分化；添加 PI3KP110β特異性抑制劑TGX-221因子用于檢測PI3KP110β對人胚胎干細(xì)胞定向分化的影響（誘導(dǎo)階段）；
　　2.胰島樣細(xì)胞通過免疫熒光染色檢測胰腺特異蛋白的表達(dá)；
　　3.通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測胰島細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)；
　　4.通過胰島素和胰高血糖素體外誘導(dǎo)釋放實(shí)驗(yàn)初步評價(jià)胰島樣細(xì)胞體外釋放功能；
　　

6、5.通過糖尿病鼠腎被膜下移植胰島樣細(xì)胞來評價(jià)胰島樣細(xì)胞在體情況下對糖尿病鼠血糖及糖尿病癥狀的影響；移植8周后處死小鼠，取出移植側(cè)腎臟進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞經(jīng)一系列培養(yǎng)，第五階段LY294002誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞數(shù)量減少，體積也較小；免疫熒光染色顯示：74.5%胰島樣細(xì)胞表達(dá)C肽，27.2%細(xì)胞表達(dá)胰高血糖素，31.3%細(xì)胞表達(dá)生長抑素，胰島素/生長抑素雙染陽性率僅3.5%，相較于Exendi

7、n-4誘導(dǎo)因子表達(dá)更低水平的胰高血糖素及生長抑素；
　　2.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：LY294002組及TGX-221組相較于Exendin-4組胰島樣細(xì)胞表達(dá)更高水平的胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽，且NKX6.1、MAFA和GLUT2等胰島成熟相關(guān)因子基因表達(dá)也明顯升高；LY294002組與 TGX-221組胰島樣細(xì)胞表達(dá)的大部分胰腺內(nèi)分泌激素及成熟因子水平相似，但TGX-221誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞的胰島素基因表達(dá)量是LY2

8、94002的近一倍，是Exendin-4誘導(dǎo)胰島樣細(xì)胞的176倍；
　　3.體外在高糖高鉀刺激下LY294002組胰島樣細(xì)胞釋放胰島素量、胰高血糖素量均是Exendin-4組的4倍，LY294002誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞具有快速釋放胰島素及胰高血糖素功能，這和胰腺組織細(xì)胞的功能相似；
　　4.將LY294002誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞移植到糖尿病模型鼠腎被膜下，一周后血糖開始下降并維持穩(wěn)定的血糖至8周，改善了糖尿病鼠的隨機(jī)血糖。另外，糖尿

9、病鼠多飲、多食、多尿、精神、毛發(fā)等糖尿病癥狀得到了改善。移植8周后處死小鼠，取出移植側(cè)腎臟進(jìn)行組織學(xué)分析，蘇木精-伊紅染色顯示胰島樣細(xì)胞在移植側(cè)腎臟組織內(nèi)存活；免疫組織化學(xué)分析顯示，在小鼠腎臟邊緣及腎實(shí)質(zhì)內(nèi)存在呈棕紅染色的人胰島素陽性細(xì)胞；移植的細(xì)胞也無成瘤性。
　　結(jié)論:
　　1.在無血清培養(yǎng)基下通過添加外源性誘導(dǎo)因子 LY294002成功誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為更加成熟的胰島樣細(xì)胞，胰島素單染陽性率高，且在體外對高葡萄