小鼠胚胎干細胞定向分化為前腦背側(cè)神經(jīng)元的體外研究.pdf

1、背景及目的：
　　 胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)是囊胚期的內(nèi)細胞團在體外建立的穩(wěn)定的細胞系。ES細胞具有干細胞的全能性，重新移植入發(fā)育中的囊胚能夠形成嵌合體小鼠，也能在體外誘導(dǎo)分化成機體多種類型的細胞，是臨床退行性病變和組織損傷的潛在替代材料。
　　 哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)發(fā)育起始于外胚層神經(jīng)上皮的誘導(dǎo)分化，形成神經(jīng)板。隨后神經(jīng)上

2、皮快速擴增，神經(jīng)板折疊并融合形成神經(jīng)管。其中，神經(jīng)管前端膨大區(qū)形成腦，后段發(fā)育為脊髓。在神經(jīng)管前部的預(yù)定腦區(qū)，神經(jīng)管局部膨大，形成結(jié)構(gòu)上區(qū)分明確的前腦(forebrain)、中腦(midbrain)和后腦(hindbrain)。前腦逐漸發(fā)育并分化為端腦(telencephalon)和間腦(diencephalon)；而端腦進一步區(qū)分為背側(cè)和腹側(cè)；背側(cè)端腦最終形成大腦皮層和海馬(以及嗅腦)。大腦皮層是一切高級神經(jīng)活動的中心，而海馬是記憶存

3、儲的主要區(qū)域，它們均來源于端腦(或者模糊稱為“前腦”)背側(cè)神經(jīng)元神經(jīng)前體細胞。小鼠大腦皮層的發(fā)育起始于胚胎第10天(E10)，增生的前體細胞位于腦室?guī)?ventricularzone，VZ)和室下帶(sub-ventricularzone，SVZ)，而新生的神經(jīng)元則離開增殖區(qū)，沿輻輳方向向表層遷移。出生時，大腦皮質(zhì)由6層細胞組成，它們按照由內(nèi)向外的順序依次生成，即先生成的神經(jīng)元位于皮質(zhì)底層，而后生成的神經(jīng)元位于皮質(zhì)表層。
　　

4、大體上，體外ES細胞向神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化方案可歸為兩大類：(1)貼壁生長的單層胚胎干細胞；(2)懸浮生長的胚胎干細胞團。前者主要依賴培養(yǎng)基和培養(yǎng)基內(nèi)生長因子的調(diào)控；后者除了培養(yǎng)基的因素，還包括細胞間的相互影響。Lee等誘導(dǎo)ES細胞形成類胚體(embryoid body，EB)，包含三個胚層起源的多種細胞類型。在這種混合細胞團中，神經(jīng)干細胞(neural stem cell，NS cell)能夠在含F(xiàn)GF2和EGF的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中得到擴

5、增；并且擴增的NS細胞經(jīng)Shh和FGF8b因子處理后，誘導(dǎo)產(chǎn)生包括多巴胺能神經(jīng)元在內(nèi)的多種中、后腦神經(jīng)元類型。
　　 控制前腦分化的信號主要有Wnt，BMP，F(xiàn)GF和Shh通路等。其中Wnt信號分子對于皮質(zhì)神經(jīng)元的產(chǎn)生和類型分化具有重要影響。在胚胎發(fā)育早期，Wnt分子沿神經(jīng)管從前到后濃度逐漸增加的梯度分布，誘導(dǎo)大腦中、后部神經(jīng)元特征。而發(fā)育相對晚期，雞胚的Wnt基因富集在預(yù)定的前腦背側(cè)或者其鄰近區(qū)域，參與前腦背側(cè)神經(jīng)元的發(fā)生和發(fā)

6、育，當Wnt信號受到阻斷時，背側(cè)神經(jīng)元標志Emxl，Pax6和Ngn2不能表達；而Wnt通路激活時，作用范圍內(nèi)的神經(jīng)元失去其腹側(cè)特征，而轉(zhuǎn)化為背側(cè)神經(jīng)元。小鼠胚胎研究中，經(jīng)典Wnt通路受到阻斷時也得到與之一致的結(jié)論。
　　 特異性基因標志是研究體內(nèi)外細胞分化的重要工具。例如，轉(zhuǎn)錄因子Sox2基因上游一段5.7 kb的序列包含一個增強子，能夠驅(qū)動Sox2基因的表達；在該增強子下游添加一段(beta)-geo序列，可觀察到該增強子激

7、活的Sox2表達最早出現(xiàn)于胚胎發(fā)育的第3.5天(embryo3.5，E3.5)，至E12.5天表達范圍局限于腦室?guī)?ventricularzone，VZ)等包含大量神經(jīng)干細胞的區(qū)域[5]。另一項研究采用Cre/loxP重組系統(tǒng)，將cre基因定點連接在FoxG1基因簇，并通過FoxG1-cre與3個不同的loxP報告基因的小鼠的雜交，得到基因重組小鼠，顯示正常的胚胎發(fā)育中，F(xiàn)oxG1分布于端腦、視泡、嗅上皮、中后腦交界等部位。最近一項研究

8、使用cre和Emx1基因重組，顯示Emx1基因表達在E9.5天開始出現(xiàn)，最早位于前腦背側(cè)，并在發(fā)育后期分布于海馬CA1-CA3區(qū)，以及齒狀核[7]。另外，一種神經(jīng)前體細胞的特異性中間絲蛋白nestin的增強子，與lacZ報告基因融合，顯示nestin在神經(jīng)板和隨后的神經(jīng)管上增生細胞中的表達。
　　 然而，這些報道中熒光蛋白尚不能代表神經(jīng)系統(tǒng)的皮層發(fā)育階段，即前腦背側(cè)神經(jīng)元的分化及增殖情況。胚胎發(fā)育12.5-15.5天對前腦背側(cè)神

9、經(jīng)元特異性標記的D6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，提供了皮質(zhì)發(fā)育的理想模型。Stefan Krauss實驗室建立的D6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶綠色熒光蛋白(green flurescentprotein，GFP)基因，該報告基因接受背側(cè)前腦特異性表達的Dach1基因增強子D6的調(diào)控。從小鼠胚胎10.5天起，前腦區(qū)域出現(xiàn)散在的GFP+細胞，逐漸分布于整個背側(cè)前腦，并持續(xù)至出生后。組織學(xué)染色證實D6-GFP+細胞主要為新皮層及海馬的神經(jīng)前體細胞和神經(jīng)元

10、。因此，本實驗的目的(1)體外擴增培養(yǎng)D6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎干細胞；(2)探索誘導(dǎo)胚胎干細胞分化的方法，觀察前腦背側(cè)神經(jīng)元/神經(jīng)前體細胞的特定亞群在體外分化和增生情況；(3)探討Wnt信號通路對胚胎干細胞向前腦背側(cè)神經(jīng)元誘導(dǎo)的影響，以期優(yōu)化誘導(dǎo)方案。
　　 方法：
　　 1.不同細胞的體外培養(yǎng)：
　　 (1)D6-GFP小鼠胚胎干細胞在添加白細胞抑制因子1000 U/ml(leukemiainhibitor

11、y factor，LIF)的含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代。
　　 (2)普通類胚體(normal embryoid body，nEB)在含5％基因敲除的血清替代物(KSR)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)；
　　 (3)快聚類胚體(quick embryoid body，qEB)在含5％基因敲除的血清替代物(KSR)的無血清培養(yǎng)基中，置于弧形底的96孔板培養(yǎng)。
　　 (4)流式分選的D6-GFP+細胞在含bFGF

12、10 ng/ml，和EGF20ng/ml，以及B271Unit/ml的神經(jīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
　　 2.免疫細胞化學(xué)檢測：分別制備不同的免疫細胞化學(xué)檢測樣本，其中胚胎干細胞檢測使用細胞爬片，nEB為附著于多聚賴氨酸的細胞球，qEB為OCT冷凝劑包埋的-20℃制備的冰凍切片，分化的神經(jīng)球細胞爬片，進行常規(guī)免疫細胞化學(xué)染色，包括固定，通透，抗原封閉，一抗孵育，二抗孵育和核染色等步驟。其中二抗使用熒光共軛抗體，反應(yīng)結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察

13、染色結(jié)果。
　　 3.定量PCR檢測：提取RNA，標本來自(1)胚胎干細胞，分化6天的nEB，分化12天的nEB，以及培養(yǎng)的前腦神經(jīng)干細胞。(2)qEB細胞中顯微解剖得到的D6-GFP陽性和非陽性細胞。使用全RNA提取試劑盒提取RNA，使用寡核苷酸引物p(NT)6合成cDNA和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR綠色熒光定量PCR試劑盒進行檢測。
　　 4.流式細胞檢測：選取不同代數(shù)的胚胎干細胞，使用胰酶/EDTA消化

14、和分散后，調(diào)節(jié)細胞終濃度為0.5×106/ml，在PBS中使用SSEA-1(IgM)單克隆抗體進行抗原-抗體反應(yīng)，加入Alexa594-熒光共軛二抗后，沖洗，使用FACS AriaⅡ流式細胞儀進行陽性細胞的定量檢測。
　　 5.流式細胞分選：取含有D6-GFP+細胞簇的快聚類胚體，使用胰酶/EDTA消化和分散后，使用FACS AriaⅡ流式細胞儀進行樣本檢測和分選。GFP信號的采集波長范圍是488±5nm。分別收集D6-GFP陽

15、性和非陽性細胞。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)處理：所有檢測重復(fù)2遍以上。定量檢測的指標中，統(tǒng)計數(shù)值使用mean±S.E.M表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.胚胎干細胞的體外擴增
　　 1.1 D6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠ES細胞的形態(tài)學(xué)：D6-GFP小鼠ES細胞呈現(xiàn)單層貼壁生長，細胞緊密排列，邊界不明顯，而成片生長的細胞周圍邊緣光滑。
　　 1.2 D6-GF

16、P小鼠ES細胞的增殖特點：小鼠ES細胞處于活躍的細胞分裂期，增殖迅速，平均約每1.5天擴增8倍。
　　 1.3 D6-GFP小鼠ES細胞表達原始細胞標志：ES細胞強表達原始干細胞特征分子Oct4和Sox2，而分化細胞(神經(jīng)元/神經(jīng)前體細胞)的標志則為陰性。
　　 2.胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化-普通類胚體
　　 2.1 普通類胚體(nEB)的形成：D6-GFP小鼠胚體干細胞懸浮生長為普通類胚體(normal emb

17、ryoid body，nEB)，nEB在1-2天內(nèi)形成，大小不等，呈現(xiàn)球形或橄欖形，培養(yǎng)早期類胚體表面光滑，細胞聚集緊密；后期在表面附著有少量壞死細胞或細胞碎片。
　　 2.2 普通類胚體(nEB)中分化細胞的基因表達的動態(tài)變化：比較胚胎干細胞，分化6d的nEB，分化12天的nEB，以及培養(yǎng)的前腦來源的神經(jīng)干細胞。結(jié)果顯示，(1)全能性干細胞的標志Oct4，Nanog，和Klf4表達逐漸減弱，前腦神經(jīng)組織的特異性分子FoxG1，

18、Pax6，Sox5，和Dach1等分子表達上調(diào)。(2)同時，Nkx2.1，Hoxb9和GFAP等非前腦組織特異分子，和Brachyury(Bra)和Vimentin等非神經(jīng)的組織特異分子的表達也有上調(diào)。(3)經(jīng)典Wnt信號通路的分子基因表達也有變化.
　　 2.3 nEB細胞分化為神經(jīng)元/神經(jīng)前體細胞：對完整的附著于玻璃蓋玻片表面的nEB，進行免疫細胞化學(xué)檢測。結(jié)果顯示nEB細胞，表達神經(jīng)相關(guān)的細胞標志nestin，Tujl和G

19、FAP。然而，在懸浮生長的nEB內(nèi)，D6-GFP+細胞幾乎不可見；經(jīng)固定和免疫細胞化學(xué)染色強化后，少數(shù)EB顯示出GFP的表達。
　　 3.胚胎干細胞向前腦背側(cè)神經(jīng)元的分化-快聚類胚體
　　 3.1 動態(tài)觀察快聚類胚體(qEB)的形成：懸浮的D6-GFP小鼠胚胎干細胞，在96孔培養(yǎng)板快速聚集(<24 hr)成快聚類胚體(quick embryoid body，qEB)。qEB形成迅速，細胞團大小一致；在相同的分化時間，細胞

20、團體積遠大于普通類胚體(nEB)。qEB通常誘導(dǎo)ES細胞產(chǎn)生D6-GFP+細胞，D6-GFP+細胞出現(xiàn)在大約分化第10天，每個qEB細胞團通常包含1-2個D6-GFP+細胞簇，D6-GFP+qEB的產(chǎn)生幾率約為40％(n=6)。使用不同因子處理，提示bFGF/EGF提高D6-GFP+qEB的幾率至75％(n+2)，但D6-GFP+細胞占細胞總數(shù)的百分比從35％減少至19.6％。同時，bFGF/EGF因子處理的D6-GFP+細胞的熒光相對

21、較暗。
　　 3.2 快聚類胚體(qEB)中分化細胞的分子標志：qEB冰凍切片的免疫細胞化學(xué)染色顯示D6-GFP+細胞與前腦背側(cè)神經(jīng)元/神經(jīng)前體細胞標志Sox2，Pax6，Tbr1和Tbr2等表達重合。D6-GFP+細胞簇內(nèi)細胞的單極表達N-cadherin分子。
　　 3.3 快聚類胚體(qEB)中D6-GFP陽性和非陽性細胞基因表達：基因表達檢測顯示前腦蛋白FoxG1和前腦背側(cè)神經(jīng)元標志Dach1，Pax6和Sox5

22、在D6-GFP陽性細胞中的表達量多于非陽性細胞。
　　 3.4 Wnt信號通路在細胞分化中的調(diào)控作用：qEB培養(yǎng)的后期用Wnt信號通路的激動劑和抑制劑處理。未處理組D6-GFP+細胞比率為35％，Wnt3a分子處理后增加至57％，Dkk1處理后減少至18％。全反式維甲酸處理，無GFP+細胞產(chǎn)生。
　　 3.5 快聚類胚體(qEB)來源的D6-GFP+細胞具有神經(jīng)干細胞特性
　　 3.5.1 D6-GFP+細胞的增

23、殖：流式細胞分選從qEB中獲得純化的D6-GFP陽性和非陽性細胞，其中D6-GFP+細胞在7-10天后形成神經(jīng)球，球內(nèi)細胞保持明亮的綠色熒光。
　　 3.5.2 D6-GFP+細胞的分化：qEB來源的D6-GFP+細胞經(jīng)神經(jīng)球培養(yǎng)擴增后，在神經(jīng)干細胞分化培養(yǎng)基(不含EGF因子)中貼壁并分化為nestin+，Tuj1+和GFAP+細胞，三者百分比分別為87.7％，9.6％，和4.2％。
　　 結(jié)論：
　　 1. D

24、6-GFP小鼠的ES細胞在體外培養(yǎng)條件下，能夠快速擴增，并維持其未分化的干細胞狀態(tài)。
　　 2. ES細胞經(jīng)普通類胚體(nEB)誘導(dǎo)，表達前腦背側(cè)神經(jīng)元/神經(jīng)前體細胞的分子標志，但未能有效誘導(dǎo)D6-GFP+細胞。
　　 3. ES細胞經(jīng)快聚類胚體(qEB)誘導(dǎo)，有效誘導(dǎo)D6-GFP+細胞。利用GFP+標記可以對前腦背側(cè)神經(jīng)元/神經(jīng)前體細胞的增生和分化進行動態(tài)觀察，定量檢測，細胞分選和分子調(diào)控等實驗。
　　 4：q