MicroRNA-17-92促進胃癌干細胞自我更新及增殖的分子機制.pdf

1、目前研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤是由一小群具有自我更新能力和多向分化潛能的癌細胞引起和維持的。這一小群癌細胞被稱為腫瘤干細胞(Cancer stem cell)或腫瘤啟動細胞(Tumor initiating cell),它們與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、抵抗化療和放療殺傷密切相關(guān)。自我更新是腫瘤干細胞區(qū)別于普通癌細胞最重要的特征之一,也是腫瘤干細胞維持自身“干性”并最終引起腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根本原因。然而,腫瘤干細胞自我更新的調(diào)控機制仍未完全闡明。<

2、br>　　miRNA是一類近年來新發(fā)現(xiàn)的長約19-22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因蛋白表達。目前研究發(fā)現(xiàn),miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。成為一類新型的癌基因或抑癌基因。腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等多種生物學(xué)過程都與miRNA密不可分。雖然miRNA的序列很小,但是一個 miRNA可以調(diào)控多個基因,形成序列放大的基因調(diào)控通路;也可以受很多基因的調(diào)控,從而在生物體內(nèi)構(gòu)

3、成了一個龐大的復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。大量研究證明,miRNA也參與了干細胞和腫瘤干細胞自我更新和多向分化潛能性的調(diào)節(jié)。例如 MiR-21、miR-134、miR-470通過靶向自我更新相關(guān)基因nanog、SOX2、OCT4調(diào)節(jié)胚胎干細胞的自我更新及分化。Let-7調(diào)控乳腺癌干細胞的自我更新和增殖等。
　　胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,因此,我們的問題是:胃癌干細胞的自我更新是如何被調(diào)控的呢?它們是否與miRNA有關(guān)呢?如果是,又有

4、哪些miRNA調(diào)控了胃癌干細胞的自我更新和增殖呢?它們參與胃癌干細胞自我更新和增殖是通過怎樣的機制完成的?對指導(dǎo)臨床工作又有怎樣的意義?這些問題成為本課題研究的內(nèi)容。
　　【目的】
　　1、尋找與胃癌干細胞自我更新相關(guān)的miRNA;2、明確候選miRNA調(diào)控胃癌干細胞自我更新和增殖的作用;3、探討候選 miRNA在胃癌組織中的表達及其臨床意義。
　　【方法】
　　1、利用tumorsphere實驗和EpCAM+/

5、CD44+胃癌表面標記物富集胃癌干細胞并進行驗證;2、利用細胞培養(yǎng)使胃癌干細胞貼壁分化,收集分化8小時、12小時、24小時和8天的細胞送miRNA芯片檢測,尋找表達逐漸缺失的miRNA分子,并利用Real-time PCR驗證芯片結(jié)果;3、構(gòu)建miRNA分子的慢病毒正義表達載體,分別感染胃癌細胞系并構(gòu)建篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞;4、利用tumorsphere實驗和NOD-SCID鼠成瘤實驗分別檢測miRNA對胃癌干細胞自我更新的影響;5、利用M

6、TT實驗、平板克隆形成試驗、裸鼠成瘤實驗等技術(shù)研究miRNA對胃癌細胞增殖的影響;6、利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫尋找miRNA促進胃癌細胞增殖和自我更新的靶基因,并通過報告基因?qū)嶒灪?Western Blot進行驗證;7、利用 real-time PCR檢測胃癌組織標本內(nèi)miRNA的表達并分析其與臨床病理資料的關(guān)系。
　　【結(jié)果】
　　1.EpCAM+/CD44+標記物和tumorsphere腫瘤球形成實驗?zāi)軌蚋患赴└杉毎?br

7、>　　2011年,Han ME等人從胃癌臨床標本內(nèi)鑒定出胃癌干細胞的細胞表面標記物是EpCAM+/CD44+。為了檢測在胃癌細胞系內(nèi)EpCAM+/CD44+的細胞是否也是胃癌干細胞,我們比較了兩個EpCAM+/CD44+含量完全相反的細胞系在無血清低粘附培養(yǎng)條件下的腫瘤球形成能力。在胃癌細胞系SGC7901中,80％的細胞表達EpCAM和CD44,并且大多數(shù)SGC7901細胞能夠在無血清低粘附的培養(yǎng)條件下形成腫瘤球,而0.2%表達EpC

8、AM+/CD44+標記物的MKN28細胞無法在無血清低粘附的培養(yǎng)條件下生成腫瘤球。由于腫瘤球形成實驗是在體外檢測細胞自我更新能力的最佳實驗,我們利用流式細胞術(shù)從胃癌細胞系內(nèi)分選到了 EpCAM+/CD44+細胞和非EpCAM+/CD44+細胞,并利用腫瘤球形成實驗檢測他們的體外自我更新能力。15天后,85-95%的EpCAM+/CD44+細胞形成了腫瘤球,而只有15-20%的非EpCAM+/CD44+細胞形成了腫瘤球。并且,EpCAM+

9、/CD44+細胞形成的腫瘤球內(nèi)的腫瘤細胞明顯多于非 EpCAM+/CD44+細胞。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗顯示,104 EpCAM+/CD44+細胞形成的腫瘤熒光信號在第15、21和28天明顯強于105非EpCAM+/CD44+細胞。這些結(jié)果表明EpCAM+/CD44+也是體外培養(yǎng)胃癌細胞系的干細胞標記物并可以用于胃癌干細胞體外研究的模型。
　　腫瘤干細胞的一個重要的特征是多潛能性。因此我們利用上述發(fā)現(xiàn)檢測胃癌干細胞是否能夠在含有血清的普

10、通培養(yǎng)條件下分化。正如我們所料,通過利用 CFSE標記和流式細胞術(shù)檢測,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤球細胞在含有血清的培養(yǎng)條件下貼壁后增殖加快。利用real-time PCR檢測我們發(fā)現(xiàn)腫瘤球細胞較貼壁的細胞表達上皮標記CK14和 CK18減少,但是,他們在含有血清的培養(yǎng)基內(nèi)貼壁分化后形態(tài)逐漸拉長,并表達較高的分化標記CK14和CK18。EpCAM+/CD44+的腫瘤球細胞在含有血清的培養(yǎng)條件下的潛在分化能力表明胃癌干細胞具有多潛能性,并且一定有一個獨

11、特的機制能夠調(diào)節(jié)這一過程。
　　2.miR-19b/20a/92a在胃癌干細胞分化過程中表達減低
　　由于miRNA能夠調(diào)節(jié)干細胞的自我更新和分化,我們培養(yǎng)了一大批富集了胃癌干細胞的腫瘤球細胞,并將這些細胞放入正常的含血清的培養(yǎng)基中使其貼壁分化,我們收集了分化8小時,12小時,1天和8天的細胞送miRNA芯片檢測。并尋找在此貼壁分化過程中表達逐漸缺失的miRNA分子。我們認為在腫瘤干細胞貼壁分化過程中表達逐漸缺失的miRNA

12、分子可能維持了胃癌干細胞的自我更新,因此才能在貼壁分化過程中表達逐漸減低。利用 Anova分析,我們鑒定出了一些在胃癌干細胞貼壁分化過程中表達逐漸缺失的miRNA分子,其中,miR-19b/20a/92a的表達差別顯著,并引起我們注意。此外,miR-106a和miR-30d等分子也與miR-19b/20a/92a有著相似的表達形式。
　　為了驗證芯片結(jié)果,我們利用real-time PCR進一步檢測了miR-19b/20a/92a

13、在胃癌干細胞和貼壁分化細胞中的表達,發(fā)現(xiàn)他們的確在貼壁8個小時后表達有所減低,貼壁1天后表達減低明顯,8天后進一步下降。我們用同樣的方法檢測了 miR-106a和miR-30d的表達,發(fā)現(xiàn)他們?nèi)匀挥信cmiR-19b/20a/92a相似的表達形式。
　　由于 miR-19b、miR-20a和 miR-92a同屬于 miR-17-92基因簇,我們選擇了miR-19b/20a/92a進行了后續(xù)的深入研究。
　　3.過表達miR-1

14、9b/20a/92a能夠促進胃癌干細胞體外腫瘤球的形成
　　為了檢測是否miR-19b/20a/92a能夠維持胃癌干細胞的自我更新,我們將慢病毒攜帶的miR-19b/20a/92a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入從SGC7901細胞分選的EpCAM-/CD44-細胞,并利用real-time PCR驗證了轉(zhuǎn)染效率。過表達lenti-miR-19b/20a/92a較對照相比能夠顯著增加胃癌細胞的腫瘤球形成能力,表明胃癌細胞的自我更新能力得到顯著增高。此外

15、,lenti-miR-19b/20a/92a穩(wěn)定表達的細胞形成的腫瘤球內(nèi)細胞數(shù)較對照組顯著增高。為了避免由于相關(guān)細胞變化導(dǎo)致的差異,我們又從 invitrogen公司購買了miR-19b/20a/92a的前體RNA和拮抗RNA,并分別瞬時轉(zhuǎn)染入EpCAM-/CD44-(或MKN28)細胞和EpCAM+/CD44+(從SGC7901細胞分離),real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效率后仍然利用腫瘤球形成實驗檢測其對自我更新的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與

16、對照組相比,瞬時轉(zhuǎn)染miR-19b/20a/92a的前體RNA能夠顯著促進EpCAM-/CD44-和MKN28胃癌細胞的腫瘤球形成能力即自我更新能力。而瞬時轉(zhuǎn)染 miR-19b/20a/92a的拮抗RNA能夠顯著降低EpCAM+/CD44+細胞和SGC7901細胞的體外自我更新能力。我們的結(jié)果表明miR-17-92基因簇的miRNA分子通過增加胃癌細胞的腫瘤球形成數(shù)目和每個腫瘤球的細胞數(shù)來在無血清低粘附的培養(yǎng)條件下調(diào)節(jié)胃癌干細胞的自我更

17、新。
　　4.過表達miR-19b/20a/92a能夠促進腫瘤球細胞對胃癌化療藥物的耐受
　　有研究表明腫瘤干細胞能夠抵抗化療藥物的作用,從而導(dǎo)致多藥耐藥的發(fā)生和繼發(fā)性腫瘤復(fù)發(fā)。我們利用MTT實驗檢測了腫瘤球細胞在胃癌化療藥物5-FU存在下的生長曲線:與對照組病毒相比,lenti-miR-19b/20a/92a感染的細胞形成的腫瘤球在化療藥物的存在下生存時間延長。這表明miR-19b/20a/92a不僅通過增加腫瘤球細胞的數(shù)

18、目,還通過誘導(dǎo)細胞對化療藥物的耐受來促進胃癌干細胞自我更新的維持。
　　5.過表達miR-19b/20a/92a能夠增加EpCAM+/CD44+細胞數(shù)
　　由于胃癌干細胞表達細胞表面標記物EpCAM+/CD44+,我們利用流式細胞術(shù)檢測是否pre-miR-19b/20a/92a轉(zhuǎn)染的細胞較對照組相比表達較多的EpCAM+/CD44+細胞表面標記物。我們發(fā)現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)染 pre-miR-19b/20a/92a能夠顯著增加EpCAM

19、+/CD44+細胞數(shù),而瞬時轉(zhuǎn)染 miR-19b/20a/92a的拮抗劑能夠顯著減低EpCAM+/CD44+細胞數(shù)。
　　6.過表達miR-19b/20a/92a能夠促進胃癌干細胞在NOD-SCID鼠中的自我更新
　　我們進一步檢測了過表達miR-19b/20a/92a對胃癌干細胞體內(nèi)自我更新的影響。為了更好的評估動物體內(nèi)的自我更新,我們利用本實驗室前期建立的熒光素酶標記的SGC7901-Luc細胞系感染病毒并建立穩(wěn)定表達m

20、iR-19b/20a/92a的細胞系,并應(yīng)用real-time PCR驗證 miRNA表達水平。每只 NOD-SCID鼠背部注射2Χ103 lenti-miR-19b/20a/92a或者 lenti-NC形成的腫瘤球。28天后,所有注射lenti-miR-19b/20a/92a細胞的NOD-SCID鼠背部均形成了腫瘤,但是只有一只lenti-NC組的NOD-SCID鼠背部形成了腫瘤(P<0.001)。并且miR-19b/20a/92a感

21、染的細胞在注射第28天后形成的腫瘤塊已經(jīng)超過了3厘米,而NC組形成的腫瘤塊在第49天,即實驗的最終點才長到2厘米。HE染色結(jié)果表明,miR-19b/20a/92a感染的細胞在NOD-SCID鼠體內(nèi)產(chǎn)生了肝和肺轉(zhuǎn)移灶,而NC組沒有轉(zhuǎn)移。
　　7.miR-19b/20a/92a促進胃癌細胞體內(nèi)外的增殖
　　干細胞調(diào)節(jié)基因一般也與細胞的增殖相關(guān)。因此,我們繼而利用MTT實驗,平板克隆形成實驗和裸鼠成瘤實驗檢測了miR-19b/20

22、a/92a在胃癌細胞體內(nèi)外增殖中的功能。體外增殖實驗顯示:miR-19b/20a/92a穩(wěn)定表達組較NC對照組促進了胃癌細胞的增殖,瞬時轉(zhuǎn)染 miR-19b/20a/92a的前體得到了相似的結(jié)果,而瞬時轉(zhuǎn)染miR-19b/20a/92a的拮抗物得到的結(jié)果相反。
　　為了驗證體外增殖實驗結(jié)果,我們利用裸鼠體內(nèi)成瘤實驗進一步檢測miR-19b/20a/92a對胃癌細胞增殖的影響。我們利用實驗室前期建立的帶有熒光標記的細胞系SGC790