bFGF激活PI3K信號(hào)通路調(diào)控大鼠胚胎干細(xì)胞自我更新.pdf

1、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）是來源于囊胚期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞能根據(jù)細(xì)胞外不同的信號(hào)，分化成不同類型的細(xì)胞，因此成為了研究再生醫(yī)學(xué)和人類疾病的強(qiáng)有力的工具。目前，盡管已經(jīng)證明能從多個(gè)物種（包括小鼠、大鼠、人、猴等）中獲取ES細(xì)胞，但只有小鼠和大鼠的ES細(xì)胞被證明能在體外培養(yǎng)條件下具有形成嵌合體動(dòng)物和保持生殖細(xì)胞遺傳能力。與最為常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠相比，大鼠具有個(gè)體大，實(shí)驗(yàn)操作方便等優(yōu)勢(shì)，因而被

2、廣泛的應(yīng)用于生理學(xué)、行為學(xué)和藥理學(xué)以及毒性測(cè)試等實(shí)驗(yàn)中。然而常用的小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件無法分離培養(yǎng)獲取大鼠胚胎干細(xì)胞，在小鼠中常用的基因敲除技術(shù)構(gòu)建動(dòng)物模型的方法在大鼠中無法實(shí)現(xiàn)，所以大鼠的應(yīng)用受到了極大的限制。因而體外維持大鼠ES細(xì)胞的自我更新顯得尤為重要。
　　近年來的研究表明維持真正胚胎干細(xì)胞系的培養(yǎng)或許可以通過控制幾個(gè)信號(hào)途徑從而維持干細(xì)胞保持在一個(gè)未分化的狀態(tài)。例如，小鼠胚胎干細(xì)胞在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下通過白血病抑制因子

3、（Leukemia Inhibitor Factor，LIF）和兩個(gè)小分子抑制劑2i（PD0325901和CHIR99021）的協(xié)同作用就能維持自我更新。同時(shí)LIF/2i的條件也可以維持大鼠ES細(xì)胞的自我更新，只是大鼠胚胎干細(xì)胞自我更新仍需要飼養(yǎng)層細(xì)胞的支持。飼養(yǎng)層細(xì)胞一般會(huì)分泌LIF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）等細(xì)胞因子。LIF可通過STAT3信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)小鼠E

4、S細(xì)胞的自我更新。bFGF主要對(duì)人胚胎干細(xì)胞的自我更新有促進(jìn)作用。而人胚胎干細(xì)胞與小鼠Epiblast來源的細(xì)胞更為相似，被認(rèn)為處于發(fā)育較晚的primed state。不過，最近多篇文獻(xiàn)在嘗試培養(yǎng)人以及獼猴na?ve iPSCs時(shí)發(fā)現(xiàn)bFGF信號(hào)通路對(duì)na?ve state胚胎干細(xì)胞也有調(diào)控作用。但飼養(yǎng)層細(xì)胞中分泌的bFGF是否能促進(jìn)大鼠ES細(xì)胞的自我更新，這一問題并不清楚。
　　本課題利用無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)條件，在LIF加2I的基

5、礎(chǔ)上，對(duì)bFGF在大鼠ES細(xì)胞自我更新中的作用進(jìn)行了探索，分析bFGF是否能調(diào)控大鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新及其可能的下游信號(hào)通路。
　　第一部分：bFGF調(diào)控大鼠ES細(xì)胞的自我更新
　　將大鼠胚胎干細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有或不含bFGF的無血清培養(yǎng)液中，通過堿性磷酸酶染色、免疫熒光以及RT-PCR分析大鼠胚胎干細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)和多能性。Western Blot檢測(cè)bFGF對(duì)大鼠胚胎干細(xì)胞PI3K信號(hào)的激活作用。利用小分子化合物抑制

6、bFGF激活的信號(hào)通路，觀察bFGF信號(hào)通路激活或抑制后大鼠胚胎干細(xì)胞的生長狀態(tài)。結(jié)果表明，在LIF加2I的基礎(chǔ)上，bFGF能明顯促進(jìn)大鼠胚胎干細(xì)胞在無飼養(yǎng)層條件下的自我更新。大鼠胚胎干細(xì)胞在此條件下能維持干性標(biāo)志基因Oct-4，Nanog的表達(dá)，同時(shí)也保持了向不同胚層細(xì)胞分化的能力。Western Blot結(jié)果顯示bFGF能促進(jìn)PI3K的磷酸化，小分子化合物直接抑制bFGF或PI3K信號(hào)通路均能抑制bFGF對(duì)大鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的促

7、進(jìn)作用。這些說明bFGF通過激活大鼠胚胎干細(xì)胞PI3K相關(guān)的信號(hào)通路促進(jìn)大鼠胚胎干細(xì)胞自我更新。
　　第二部分：無飼養(yǎng)層細(xì)胞條件下大鼠ES細(xì)胞的原代分離和培養(yǎng)
　　將DA大鼠發(fā)育至4.5天的囊胚分離，在LIF+2i+bFGF和無飼養(yǎng)層的條件下培養(yǎng)，結(jié)果顯示，LIF+2i+bFGF能維持囊胚生長并逐漸形成克隆和傳代培養(yǎng)，而沒有添加bFGF的條件下，囊胚沒有形成明顯的細(xì)胞克隆。結(jié)合第一部分的結(jié)果表明LIF+2i+bFGF不僅能維