NDV調(diào)控PI3K介導(dǎo)的信號通路研究.pdf

1、新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）感染引起的一種高度接觸性傳染病。強(qiáng)毒NDV能引起感染鳥類消化道和呼吸道出血或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。自1926年在印度尼西亞和1927年在英國首次暴發(fā)ND以來，該疾病現(xiàn)已呈全球分布，包括亞洲、歐洲、非洲和南美洲等全球六大洲都曾多次報(bào)道過ND的疫情。目前在全球的多個(gè)國家以Class I、ClassII基因VI型和基因VII型的N

2、DVs流行和傳播為主；但如基因XVII型和基因XVIII型等新型的NDV毒株不斷在非洲等國家出現(xiàn)。NDV的宿主范圍非常廣，能感染超過250種鳥類，而野鳥一直被認(rèn)為是NDV的天然宿主和傳播載體，帶毒的野鳥可能通過直接接觸在鳥類，甚至在家禽間傳播該疾病，對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,然而目前帶毒的野鳥和家禽之間的傳播模式仍然有待進(jìn)一步研究。因此，從2010年開始，我們對廣東省活鳥市場進(jìn)行NDV的流行病學(xué)監(jiān)測，并且進(jìn)一步研究在不同宿主上分離到的

3、NDV對不同鳥類的致病性和傳播特性。
　　在本研究中，從廣東省活鳥市場中雞、鴨和鴿等宿主中分離到25株NDVs，并對這25株NDVs的基因型和致病特性進(jìn)行了分析。為了模擬活鳥市場不同種鳥類的自然傳播特性，選擇了其中5株分別分離于雞（GM）、鴨（SS-10、NH-10和YF18）、鴿（GZ289）不同宿主的代表性毒株，研究它們分別對雞、鴨和鴿不同宿主的致病性和傳播特性。對雞、鴨和鴿通過點(diǎn)眼滴鼻方式分別以106 EID50接種病毒，感

4、染8 h后，分別在每個(gè)感染組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中放置相對應(yīng)的3個(gè)同居對照動(dòng)物做水平傳播實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣東省內(nèi)活鳥市場存在多種NDV的基因型，并且來源不同的鳥類有不同的組織趨性和宿主范圍。
　　病毒感染與致病是病毒和宿主相互作用的結(jié)果，既有病毒為逃避宿主防御機(jī)制而發(fā)揮抗病毒作用，維持自身的復(fù)制，也有宿主為清除病毒而調(diào)動(dòng)固有免疫體系迅速產(chǎn)生效應(yīng)分子和免疫效應(yīng)，構(gòu)建機(jī)體抵御病毒入侵的生物防線。為了闡明NDV的致病機(jī)制，本研究通過NDV感染雞

5、胚成纖維（Chicken embryo fibroblast，CEF）細(xì)胞在病毒感染早期短暫激活PI3K/Akt信號通路，并且在NDV感染CEF細(xì)胞15 min后觀察到Akt磷酸化。而NDV激活A(yù)kt的磷酸化在感染后1 h達(dá)到頂峰，感染24 h后逐漸減弱。紫外滅活的NDV也能夠激活PI3K/Akt信號通路，表明激活這條信號通路并不需要病毒復(fù)制。另外，在NDV感染CEF細(xì)胞前先用PI3K特異性抑制劑LY294002或者Wortmannin

6、處理CEF細(xì)胞后再用NDV感染處理過的細(xì)胞，能夠明顯觀察到Akt的磷酸化被抑制了，同時(shí)NDV病毒滴度也減少。最后，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用的抑制劑甲基-β-環(huán)糊精和氯丙嗪能夠抑制GM和F48E9毒株誘導(dǎo)的Akt磷酸化，卻對疫苗毒La sota誘導(dǎo)的Akt磷酸化沒有明顯影響，提示NDV侵入細(xì)胞可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。然而，抑制PI3K/Akt信號通路的激活能夠加強(qiáng)NDV感染CEF細(xì)胞早期誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)，如Caspase3和PA

7、RP裂解加強(qiáng)、GSK3β磷酸化減少和AnnexinV-FITC/PI染色的凋亡細(xì)胞增多。此外，泛半胱天冬酶抑制劑ZVAD-FMK和PI3K抑制劑LY294002能夠通過抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)PI3K激活，導(dǎo)致Akt磷酸化增多和病毒復(fù)制增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)NDV感染的細(xì)胞宿主生存，提示PI3K/Akt信號通路具有抗凋亡作用和促進(jìn)NDV復(fù)制。
　　根據(jù)底物特異性和序列同源性，PI3K分為3類:class I、class II和class III。

8、PI3K I類激活A(yù)kt/mTOR信號通路，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝活動(dòng)抑制自噬，然而PI3K III類Vps34結(jié)合Vps15轉(zhuǎn)換PI為PI(3)P促進(jìn)自噬的發(fā)生。NDV既能誘導(dǎo)自噬，也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盡管細(xì)胞凋亡和自噬承擔(dān)不同的形態(tài)特征和生理過程，然而兩者之間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用仍然不明確。因此為了深入闡明NDV的致病機(jī)制和探討NDV與宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，本研究分析了NDV誘導(dǎo)PI3K介導(dǎo)的自噬和細(xì)胞凋亡對NDV復(fù)制的作用

9、。在本研究中，相對于陰性對照組，NDV感染或者饑餓誘導(dǎo)CEF細(xì)胞在早期能觀察到LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化、p62/SQSTM1發(fā)生降解和通過透射電子顯微鏡觀察到自噬體增多等現(xiàn)象，表明NDV感染或者饑餓誘導(dǎo)CEF細(xì)胞能夠誘導(dǎo)自噬。然而紫外滅活的NDV感染CEF細(xì)胞卻沒有能夠觀察到LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化、p62/SQSTM1降解等現(xiàn)象，同時(shí)Caspase3和PARP也未發(fā)生裂解，說明自噬體的產(chǎn)生需要病毒復(fù)制。在體內(nèi)外NDV感染實(shí)驗(yàn)發(fā)

10、現(xiàn)，NDV感染早期可以觀察到Caspase3和PARP分裂以及通過FITC-V/PI染色的凋亡細(xì)胞數(shù)均表明抑制自噬能夠加強(qiáng)細(xì)胞凋亡反應(yīng)。類似地，誘導(dǎo)自噬減少細(xì)胞凋亡反應(yīng)。此外，除了Beclin1，誘導(dǎo)自噬能夠增加NDV感染SPF雞的脾臟和肺臟中的自噬相關(guān)基因、抗凋亡因子（Bcl-2和Bcl-xL）和促炎癥因子（IL-6和IL-1β）的表達(dá)水平，同時(shí)減少脾臟和肺臟中的凋亡細(xì)胞。然而半胱天冬酶通用抑制劑ZVAD-FMK抑制細(xì)胞凋亡能夠促進(jìn)L