脾細(xì)胞輸注致敏對(duì)造血干-祖細(xì)胞植入的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文擬通過(guò)同種異基因脾細(xì)胞輸注的方法建立致敏的動(dòng)物模型，深入探討致敏對(duì)HSCT的影響及作用機(jī)制。 第一部分脾細(xì)胞輸注致敏模型的建立及其對(duì)移植的影響 目的：建立脾細(xì)胞致敏的動(dòng)物模型，研究致敏動(dòng)物體內(nèi)免疫功能的改變，并探討致敏對(duì)HS/PCs植入的影響。 方法： 1.致敏模型的建立,于脾細(xì)胞輸注結(jié)束后第7天檢測(cè)BALB/c小鼠的免疫功能并將其作為移植受者。 2.免疫功能檢測(cè)： 2.1由尾靜脈采血

2、檢測(cè)各組受者血常規(guī)及應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾細(xì)胞CD3+、CD19+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分比。 2.2分離各組受者的血清，通過(guò)補(bǔ)體依賴(lài)淋巴細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清抗體滴度，ELISA方法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IFN—γ的水平。 2.3分離各組致敏受者的脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，C57BL/6小鼠脾臟細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，以3H—TdR進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)計(jì)算刺激指數(shù)。 3.異基因骨髓移植： 3.1移植前5天各組

3、BALB/c小鼠開(kāi)始飲用含抗生素的飲用水，同時(shí)建立照射未移植組。 3.2每天觀察移植后受鼠的生存情況，瀕死動(dòng)物取肝、肺、脾、腸管、足墊皮膚等組織作病理檢查。 4.統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。 結(jié)果： 1.各組受者血象及外周血中CD3+、CD19+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分比的差異均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.致敏血清中細(xì)胞毒性指數(shù)均高于正常對(duì)照組，且其數(shù)值與脾細(xì)胞輸注的數(shù)量及次數(shù)呈正相關(guān)

4、。 3.各組血清中IFN—γ均很低，致敏組血清IFN—γ與正常組的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.MLR實(shí)驗(yàn)結(jié)果示1×10E5組的刺激指數(shù)稍高于正常組，但其差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而1×10E6組及1×10E6 qw×2組的刺激指數(shù)均明顯高于正常組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.單純照射未移植組的小鼠于照射后10～16天全部死亡。 6.瀕死前取股骨病理檢查證明骨髓細(xì)胞明顯衰竭，而肝臟、腸管、皮墊等組織均未發(fā)現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞

5、浸潤(rùn)。 結(jié)論： 1.通過(guò)同種異基因脾細(xì)胞輸注的方法建立了不同致敏程度的動(dòng)物模型。 2.異基因供者HS/PCs不能挽救經(jīng)致死量照射的脾細(xì)胞輸注致敏模型。 3.1×10E6 qw×2脾細(xì)胞輸注組的致敏程度最高，符合臨床反復(fù)輸血致敏的過(guò)程，將以此致敏模型進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)研究。 第二部分異基因造血干/祖細(xì)胞在致敏模型的歸巢與植入 目的：探討異基因HS/PCs在致敏模型的歸巢與植入情況，明確異基因HS

6、/PCs在致敏受者體內(nèi)的去向。 方法： 1.致敏模型與骨髓移植。 2.歸巢的觀察指標(biāo)： 2.1 CFSE標(biāo)記供者骨髓細(xì)胞：取染色后的骨髓細(xì)胞即時(shí)及體外培養(yǎng)48小時(shí)后予流式細(xì)胞儀檢測(cè)，另取染色后的骨髓細(xì)胞即時(shí)進(jìn)行移植。 2.2病理切片示蹤：分別于移植后第2hr、12hr及48hr處死移植受者，取其眼靜脈血進(jìn)行涂片，并取股骨、脾臟、肝臟及肺臟行冰凍切片，于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野中熒光細(xì)胞數(shù)。

7、 2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)：同時(shí)于上述時(shí)點(diǎn)制備致敏模型的脾臟細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及眼靜脈血，以紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光的強(qiáng)度。 3.植入的觀察指標(biāo)： 3.1生存分析：移植后每日觀察致敏模型的生存狀況，記錄死亡時(shí)間，繪制生存曲線(xiàn)。 3.2外周血象恢復(fù)：移植后每周從致敏模型尾靜脈采血20μl，用KX—21血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)WBC、Hb及PLT等。 3.3骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)：移植后每周分離致敏模型的股骨，計(jì)

8、數(shù)每根股骨中骨髓細(xì)胞的數(shù)量，并取骨髓細(xì)胞進(jìn)行以下集落培養(yǎng)及嵌合分析。 3.4集落培養(yǎng)：取2×104骨髓細(xì)胞置于1ml甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系進(jìn)行集落培養(yǎng)，7天后計(jì)算CFU—GM集落數(shù)。 3.5嵌合分析：取受者骨髓細(xì)胞予FITC—H—2Db標(biāo)記，檢測(cè)供者HS/PCs嵌合程度。 4.統(tǒng)計(jì)分析：與第一部分相同。 結(jié)果： 1.予綠色熒光染料CFSE體外標(biāo)記供者骨髓細(xì)胞，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.

9、歸巢實(shí)驗(yàn)的冰凍切片結(jié)果顯示，熒光標(biāo)記供者細(xì)胞在受者肝臟、肺臟的分布隨時(shí)間推移呈逐漸減少。 3.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示移植后2小時(shí)，熒光細(xì)胞在非致敏組與致敏組的骨髓及脾臟的分布無(wú)明顯差異。 4.非致敏及致敏受者予照射及異基因骨髓移植后經(jīng)Log—rank檢驗(yàn)兩組的生存率差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.非致敏組受者于移植照射后其血象及骨髓細(xì)胞隨時(shí)間推移呈進(jìn)行性增加，于移植后第28天已恢復(fù)到正常水平；而致敏組受者同樣經(jīng)照射移植后

10、其血象及骨髓細(xì)胞隨時(shí)間推移呈進(jìn)行性下降。 6.移植后取受者骨髓細(xì)胞進(jìn)行集落培養(yǎng)。 7.供者細(xì)胞嵌合分析結(jié)果。 結(jié)論： 1.歸巢實(shí)驗(yàn)表明，與非致敏移植受者相比，異基因供者HS/PCs主要在致敏受者外周血、骨髓及脾臟等部位被清除。 2.通過(guò)植入實(shí)驗(yàn)的多種研究方法表明異基因供者HS/PCs在非致敏受者體內(nèi)能有效植入，而在致敏受者體內(nèi)卻被完全排斥。 第三部分致敏對(duì)異基因造血干/祖細(xì)胞損傷的機(jī)制研究

11、 目的：分析致敏受者血清及免疫細(xì)胞對(duì)異基因HS/PCs的損傷作用，探討致敏受者產(chǎn)生移植排斥的機(jī)制。 方法： 1.致敏模型：同樣按第一部分建立的致敏模型。 2.二抗結(jié)合實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。 3.免疫損傷機(jī)制： 3.1 CDC實(shí)驗(yàn)：將致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清與C57BL/6骨髓細(xì)胞于體外孵育不同時(shí)間，再加入兔補(bǔ)體繼續(xù)孵育30 min，然后予熒光染料EB/AO標(biāo)記，計(jì)算細(xì)胞死

12、亡百分比。 3.2 CTL實(shí)驗(yàn)：分離致敏或非致敏BALB/c小鼠脾細(xì)胞，檢測(cè)骨髓細(xì)胞的死亡百分比，計(jì)算細(xì)胞毒性指數(shù)。 3.3 ADCC實(shí)驗(yàn)：再加入熒光標(biāo)記PE—PI，計(jì)算細(xì)胞毒性指數(shù)。 4.血清對(duì)HS/PCs凋亡的影響：加熒光標(biāo)記FITC—AnnexinV，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。 5.血清對(duì)造血祖細(xì)胞增殖分化的影響：C57BL/6骨髓細(xì)胞與致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清于37℃孵育90min，然后加

13、入終濃度為10％的兔補(bǔ)體，再孵育30min，洗滌后重懸細(xì)胞，骨髓細(xì)胞置于1ml甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系進(jìn)行集落培養(yǎng)，計(jì)數(shù)CFU—GM。 6.血清孵育或過(guò)繼輸注的移植實(shí)驗(yàn)： 6.1將致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清與供者C57BL/6骨髓細(xì)胞在體外孵育1小時(shí)，洗滌后回輸?shù)浇?jīng)8Gy照射后的BALB/c小鼠，觀察移植后的生存情況。 6.2在移植前1天將200μl致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清注射到正常BALB/c

14、小鼠中，經(jīng)8Gy照射后予移植1×107C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞，觀察移植后生存情況。 7.統(tǒng)計(jì)分析：與第一部分相同。 結(jié)果： 1.經(jīng)非致敏或致敏血清孵育的骨髓細(xì)胞與羊抗鼠IgG二抗結(jié)合，兩組差別有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.CDC實(shí)驗(yàn)結(jié)果示在與補(bǔ)體孵育30min或1hr后，致敏血清組死亡細(xì)胞百分比明顯高于非致敏血清組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CTL實(shí)驗(yàn)中，非致敏血清組與致敏血清組的細(xì)胞毒性指數(shù)差別有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意

15、義；ADCC實(shí)驗(yàn)中，兩組的細(xì)胞毒性指數(shù)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果示非致敏組與致敏組的骨髓細(xì)胞，兩組差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.集落培養(yǎng)結(jié)果示非致敏組與致敏組的骨髓細(xì)胞中CFU—GM數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.血清孵育骨髓細(xì)胞后進(jìn)行移植，經(jīng)Log—rank檢驗(yàn)兩組的生存率差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.血清過(guò)繼移植實(shí)驗(yàn)中，移植前予致敏血清輸注的受者有80％也于移植后10天左右均死于骨髓衰竭，而接受非致

16、敏血清輸注的受者能長(zhǎng)期存活，經(jīng)Log—rank檢驗(yàn)兩組的生存率差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.致敏血清抗體能與異基因HS/PCs相結(jié)合，致敏受者能通過(guò)免疫途徑CDC、CTL、ADCC等免疫途徑損傷異基因HS/PCs。 2.致敏血清對(duì)異基因HS/PCs凋亡及體外增殖分化均無(wú)明顯影響。 3.血清孵育及過(guò)繼移植實(shí)驗(yàn)均表明致敏血清能引起異基因HS/PCs的移植失敗，說(shuō)明血清抗體介導(dǎo)的體液免疫在移植排斥中發(fā)揮重

17、要作用。 全文結(jié)論 1.通過(guò)同種異基因脾細(xì)胞輸注的方法建立不同致敏程度的動(dòng)物模型，該致敏模型體內(nèi)免疫功能的變化與脾細(xì)胞輸注的數(shù)量及次數(shù)有關(guān)。 2.歸巢實(shí)驗(yàn)表明，異基因供者HS/PCs主要在致敏受者外周血、骨髓及脾臟等部位被清除。 3.通過(guò)植入實(shí)驗(yàn)的多種研究方法表明異基因供者HS/PCs在非致敏受者體內(nèi)能有效植入，而在致敏受者體內(nèi)卻被完全排斥。 4.致敏血清抗體能與異基因HS/PCs相結(jié)合，致敏受者