280nm LED紫外線對(duì)鼠白血病細(xì)胞L1210及造血干-祖細(xì)胞影響的體內(nèi)外研究及機(jī)制探討.pdf

1、第一部分：280nm LED紫外線對(duì)鼠白血病細(xì)胞L1210及造血干/祖細(xì)胞影響的體內(nèi)外研究
　　目的：
　　體外凈化是自體造血干細(xì)胞移植治療的關(guān)鍵，本研究以280nm LED紫外線（ultraviolet LED, UV LED）為研究對(duì)象，觀察280nm UV LED對(duì)鼠白血病細(xì)胞L1210及造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC）的體內(nèi)外影響。
　　

2、方法：
　　1.造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）的分選：獲取小鼠的骨髓細(xì)胞，采用生物素或PE標(biāo)記的SCA1抗體，經(jīng)免疫磁珠分選得到HSC，流式細(xì)胞儀檢測HSC的純度。
　　2. UV LED對(duì)兩種細(xì)胞集落形成的影響：L1210細(xì)胞及HSC經(jīng)0、2.4、4.8、7.2、9.6、12、14.4、16.8、19.2J/m2的UV LED照射后，接種于MethoCulTMGF M3434甲基纖維

3、素培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下分別培養(yǎng)8、12天，計(jì)數(shù)集落的數(shù)量。
　　3. UV LED對(duì)兩種細(xì)胞增殖的影響：L1210細(xì)胞及HSC經(jīng)0、28、56、112、224J/m2的UV LED照射后，在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24 h，采用CCK-8檢測兩種細(xì)胞的增殖情況。
　　4. UV LED對(duì)兩種細(xì)胞凋亡的影響：L1210細(xì)胞及HSC經(jīng)0、28、56、112、2

4、24J/m2的UV LED照射后，在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24 h（檢測HSC凋亡時(shí)只培養(yǎng)24 h），采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測兩種細(xì)胞的凋亡情況。
　　5. UV LED對(duì)外周血HSC移植的影響：受鼠（雌鼠）移植前接受9 Gy X線全身照射的清髓性預(yù)處理，將2×107個(gè)DBA/2雄鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)0、9.6J/m2的UV LED照射后通過尾靜脈注入受鼠體內(nèi)，觀

5、察兩組小鼠的生存率（觀察時(shí)間為90天）、血常規(guī)（d7、d14、d21、d42、d60）及移植后d60外周血、骨髓細(xì)胞、脾臟DNA中sry基因表達(dá)情況。
　　6. UV LED對(duì)L1210細(xì)胞體內(nèi)局部致瘤能力的影響：將2×105個(gè)L1210細(xì)胞經(jīng)0、224J/m2的UV LED照射后注入DBA/2雌鼠的左前肢腋下，觀察兩組小鼠的腫瘤生長情況、生存率（觀察時(shí)間為90天）及組織病理學(xué)形態(tài)。
　　7. UV LED對(duì)L1210細(xì)胞體

6、內(nèi)血行轉(zhuǎn)移能力的影響：受鼠（雌鼠）移植前接受2 Gy X線全身照射+環(huán)磷酰胺的非清髓預(yù)處理，將2×105個(gè)L1210細(xì)胞經(jīng)0、9.6J/m2的UV LED照射后與2×107個(gè)DBA/2雄鼠骨髓細(xì)胞混合，經(jīng)尾靜脈注入受鼠體內(nèi)，觀察兩組小鼠的一般情況、生存率（觀察時(shí)間為90天）、骨髓細(xì)胞甩片及組織病理學(xué)形態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1. HSC的純度：采用PE標(biāo)記的SCA1抗體經(jīng)免疫磁珠分選得到HSC（PE陽性），經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測純度

7、高達(dá)97.1%。
　　2. UV LED對(duì)兩種細(xì)胞集落形成的影響：UV LED在0-19.2J/m2的劑量范圍內(nèi)可顯著抑制CFU-L1210、CFU-HPC（P均＜0.01），并呈劑量依賴性。在2.4-14.4J/m2的劑量范圍內(nèi)，UV LED對(duì)CFU-L1210的抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)CFU-HPC的作用（P均＜0.05），以9.6J/m2最為顯著。
　　3. UV LED對(duì)兩種細(xì)胞增殖的影響：在0-224J/m2照射劑量、孵

8、育時(shí)間3-24h范圍內(nèi)，UV LED可顯著抑制L1210細(xì)胞及HSC的增殖（P均＜0.05），并呈劑量與時(shí)間依賴性。除照射劑量為28J/m2、孵育3h時(shí)HSC與L1210細(xì)胞的增殖率無顯著性差異外（t=1.28，P=0.27），其余各組UV LED對(duì)L1210細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)HSC的作用（P均＜0.05）。
　　4. UV LED對(duì)兩種細(xì)胞凋亡的影響：在0-224J/m2照射劑量、孵育時(shí)間3-6h范圍內(nèi)，UV LED照

9、射不能顯著增加L1210細(xì)胞的凋亡率（P均＞0.05）；當(dāng)孵育時(shí)間延長到12h及24h時(shí)，UV LED可使L1210細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P均＜0.05），并呈劑量與時(shí)間依賴性；照射劑量為224J/m2、孵育24h時(shí)L1210細(xì)胞的凋亡率達(dá)到最高。在56-224J/m2照射劑量、孵育24h時(shí)，UV LED可誘導(dǎo)HSC的凋亡（P均＜0.05），但無劑量依賴性。UV LED在0-224J/m2照射劑量、孵育24h時(shí)對(duì)L1210細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)

10、作用明顯強(qiáng)于對(duì)HSC的作用（P均＜0.01），以224J/m2最為顯著。
　　5. UV LED對(duì)外周血HSC移植的影響：對(duì)照組小鼠除1只于d4死亡外，余小鼠及實(shí)驗(yàn)組小鼠存活時(shí)間均＞90天，兩者生存率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（X2=1.00, P=0.32）；兩組小鼠d7、d14、d21、d42、d60的WBC、RBC、Hb及PLT比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），至d14兩組小鼠的造血功能均恢復(fù)正常；移植后d60兩組小鼠的外周血、骨

11、髓細(xì)胞及脾臟DNA中均可檢測到sry基因，即供鼠細(xì)胞在受鼠體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定嵌合狀態(tài)。
　　6. UV LED對(duì)L1210細(xì)胞體內(nèi)局部致瘤能力的影響：對(duì)照組小鼠的成瘤率達(dá)100%，至d21全部死亡，而實(shí)驗(yàn)組小鼠均未出瘤，存活時(shí)間均＞90天，生存率明顯高于對(duì)照組小鼠（X2=11.76，P=0.00）；對(duì)照組小鼠的脾臟中可見白血病細(xì)胞浸潤，而實(shí)驗(yàn)組小鼠的各器官中均未見白血病細(xì)胞。
　　7. UV LED對(duì)L1210細(xì)胞體內(nèi)血行轉(zhuǎn)移能力

12、的影響：對(duì)照組小鼠d21出現(xiàn)體重持續(xù)下降，d52相繼出現(xiàn)精神萎靡、飲食不佳、弓背、皮毛無光澤并脫毛、呼吸困難、雙下肢癱瘓，最終進(jìn)展到惡病質(zhì)并死亡，解剖發(fā)現(xiàn)脾臟較同期實(shí)驗(yàn)組小鼠明顯腫大，中位生存期為56天；實(shí)驗(yàn)組小鼠d28出現(xiàn)體重持續(xù)下降，d80相繼出現(xiàn)上述癥狀，中位生存期為84天，生存率明顯高于對(duì)照組小鼠（X2=12.02，P=0.00）；對(duì)照組瀕死小鼠的脾臟、股骨骨髓、椎體、脊髓及硬膜外腔可見白血病細(xì)胞浸潤，而實(shí)驗(yàn)組瀕死小鼠在椎體、脊

13、髓及硬膜外腔中發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞，其余各臟器均未見白血病細(xì)胞。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的白血病發(fā)病晚，且白血病細(xì)胞浸潤程度輕。
　　結(jié)論：
　　1.280nm UV LED體外可選擇性殺傷白血病細(xì)胞L1210，并具有劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)，其機(jī)制包括抑制集落形成、抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而對(duì)HSC的影響較小。
　　2.280nm UV LED具有體外凈化的作用，UV LED照射后的L1210細(xì)胞體內(nèi)局部致瘤及血行轉(zhuǎn)移的能力

14、顯著下降，小鼠白血病發(fā)病晚且白血病細(xì)胞浸潤程度輕，而UV LED照射后的HSC在體內(nèi)仍保留造血重建的能力。
　　第二部分：蛋白激酶在UV LED誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞凋亡中的作用
　　目的：
　　UV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由多條信號(hào)通路參與的高度復(fù)雜的生物學(xué)過程，其中蛋白激酶家族在凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。本研究通過觀察280nm UV LED對(duì) PKA、PKCβ基因、蛋白等表達(dá)的影響，探討PKA、PKCβ在UV LED誘導(dǎo)

15、的L1210細(xì)胞凋亡中的作用。
　　方法：
　　以0（對(duì)照組）、224J/m2（實(shí)驗(yàn)組）的UV LED照射L1210細(xì)胞，于37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)24 h。采用RT-qPCR的方法檢測prkacb、prkcb基因的mRNA表達(dá)、Western blot檢測PKA、PKCβ的蛋白表達(dá)、焦磷酸測序檢測prkacb、prkcb基因的甲基化水平。將L1210細(xì)胞分別與10μM PKA的抑制劑KT5710及5μM P

16、KCβ的抑制劑 Enzastaurin共同孵育12h，各對(duì)照組細(xì)胞均與等量的 DMSO共孵育12h，采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1.兩組細(xì)胞prkacb、prkcb基因mRNA的表達(dá)量：以對(duì)照組prkacb、prkcb的mRNA表達(dá)量為參照（看作1），實(shí)驗(yàn)組prkacb的mRNA表達(dá)量為(0.22±0.03)，明顯低于對(duì)照組（t=51.06, P=0.00）；實(shí)

17、驗(yàn)組prkcb的mRNA表達(dá)量為（0.39±0.04），明顯低于對(duì)照組（t=26.41, P=0.00）。
　　2.兩組細(xì)胞PKA、PKCβ蛋白的表達(dá)量：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組PKA的蛋白表達(dá)量分別為（1.04±0.15）、（0.37±0.06），兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=8.25, P=0.00）；對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組 PKCβ的蛋白表達(dá)量分別為（1.18±0.12）、（0.53±0.04），兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=10.62, P=0.0

18、0）。
　　3.兩組細(xì)胞prkacb、prkcb基因的甲基化水平：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組prkacb基因兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平分別為（85.33±1.51）%、（86.17±1.17）%；（84.33±2.58）%、（82.33±1.37）%，兩組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組prkcb基因九個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平分別為（97.00±0.63）%、（97.17±0.75）%；（95.67±1.37）%、（95.67±1.5

19、1）；（92.83±0.41）%、（93.17±0.41）%；（90.00±0.41）%、（90.33±1.37）%；（95.67±3.93）%、（96.17±2.93）%；（85.33±0.52）%、（85.50±0.84）%；（93.17±1.72）%、（93.17±0.75）%；（96.17±0.75）%、（96.67±0.52）%；(96.50±0.55)%、(96.17±1.17)%，兩組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。

20、
　　4. KT5720對(duì) L1210細(xì)胞凋亡率的影響：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與10μM溶于 DMSO的KT5720共孵育12h，而對(duì)照組細(xì)胞與等量DMSO共孵育12h，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率分別為（8.69±0.34）%、（39.66±8.56）%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=6.26, P=0.02）。
　　5. Enzastaurin對(duì) L1210細(xì)胞凋亡率的影響：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與5μM溶于 DMSO的Enzastaurin共孵育1

21、2h，而對(duì)照組細(xì)胞與等量DMSO共孵育12h，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率分別為（6.77±0.46）%、（17.11±1.29）%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=13.07, P=0.00）。
　　結(jié)論：
　　1. PKA、PKCβ在L1210細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用。
　　2.280nm UV LED可降低L1210細(xì)胞prkacb、prkcb基因的mRNA及PKA、PKCβ的蛋白表達(dá)，參與UV LED誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。