miR-21調(diào)控CML白血病干-祖細胞對格列衛(wèi)的凋亡抗性及其機制研究.pdf

1、慢性粒細胞白血?。–hronic Myeloid Leukemia，CML）是一種起源于白血病干細胞（leukemia stem cells，LSCs)的惡性增殖性疾病，迄今沒有有效的根治辦法。目前國內(nèi)外的研究普遍認(rèn)為LSC是正常造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSCs）經(jīng)BCR-ABL癌基因轉(zhuǎn)化而來。由于BCR-ABL基因編碼的BCR-ABL融合蛋白具有持續(xù)活化的酪氨酸激酶活性，使得LSC具有比HSC更強的

2、自我更新和增殖能力而大量擴增。LSCs也因此被認(rèn)為是CML發(fā)病的根源，靶向BCR-ABL清除LSCs對于治愈CML具有重要的臨床意義。格列衛(wèi)（Imatinib Mesylate，IM）是以BCR-ABL蛋白為靶點治療CML的分子靶向藥物，能使絕大部分CML患者獲得有效緩解，成為當(dāng)前CML治療的一線藥物。然而，研究發(fā)現(xiàn)IM只能殺死增殖的成熟CML細胞而不能有效誘導(dǎo)LSCs凋亡。因此，IM不能徹底清除CML患者體內(nèi)的LSCs而無法根治CML

3、。LSCs對格列衛(wèi)的凋亡抗性機制迄今不完全清楚。闡明LSCs的格列衛(wèi)凋亡抗性機制對于以LSCs為靶點制定根治CML的策略具有重要意義。大量的研究表明，miR-21的異常表達與腫瘤細胞耐藥密切相關(guān)miR-21抑制劑能有效增強化療藥物對腫瘤細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。目前，miR-21在LSCs中的表達及其與LSCs的格列衛(wèi)凋亡抗性的關(guān)系尚無研究報道，有待深入探討。
　　本論文采用Real-time PCR技術(shù)檢測IM處理后CML CD34+

4、干/祖細胞以及Sup-b15細胞和CML細胞K562、Ku812的miR-21的表達水平變化，在此基礎(chǔ)上，進一步通過miR-21激動劑及其抑制劑轉(zhuǎn)染、流式細胞術(shù)等方法，研究miR-21在調(diào)控CMLCD34+干/祖細胞對IM的凋亡抗性中的作用及其分子機制。
　　目的：
　　本論文通過研究miR-21在調(diào)控CD34+干/祖細胞對IM的凋亡抗性中的作用及其分子調(diào)控機制，探索增強IM清除LSCs的策略，為以LSCs為靶點根治CML提

5、供參考資料和科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.探討miR-21在調(diào)控CML CD34+干/祖細胞對IM凋亡抗性中的作用
　　1.1.使用Ficoll利用密度梯度離心法把健康人和CML病人的骨髓樣本進行分離，分別獲得健康人和CML病人的骨髓單個核細胞（BMMC）；利用免疫磁珠分選系統(tǒng)（MACS）對健康人和CML病人的骨髓單個核細胞分別進行分選，獲得健康人和CML病人CD34+干/祖細胞；流式細胞術(shù)鑒定CD34+干/祖細胞的

6、分子表型及其純度。
　　1.2.Annexin V/PI雙染法檢測IM誘導(dǎo)的CML CD34+干/祖細胞凋亡；Real-time PCR檢測IM處理后CML CD34+細胞的miR-21表達水平；Annexin V/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染antagomiR-21對IM誘導(dǎo)的CML CD34+細胞凋亡的影響。
　　1.3.MTS方法檢測IM對Sup-b15細胞增殖的影響；Annexin V/PI雙染法檢測IM誘導(dǎo)的Sup-b15細

7、胞凋亡；Real-time PCR檢測IM處理后Sup-b15細胞的miR-21表達水平；Annexin V/PI雙染法檢測Sup-b15細胞轉(zhuǎn)染antagomiR-21后，IM誘導(dǎo)的細胞凋亡變化。
　　1.4.MTS方法檢測IM對CML細胞K562和Ku812的細胞增殖影響；Annexin V/PI雙染法檢測IM誘導(dǎo)的CML細胞K562和Ku812的細胞凋亡；Real-time PCR檢測IM處理后CML細胞K562和Ku812

8、的miR-21表達水平；Annexin V/PI雙染法檢測K562和Ku812轉(zhuǎn)染agomiR-21后，IM誘導(dǎo)的細胞凋亡變化。
　　2.探討miR-21調(diào)控CML CD34+細胞對IM凋亡抗性的分子機制研究
　　2.1.流式細胞術(shù)檢測 CML CD34+細胞和三種 Ph+白血病細胞(K562、Ku812、Sup-b15）細胞經(jīng)過IM處理后細胞內(nèi)PTEN和PDCD4蛋白的表達水平變化；檢測CD34+干/祖細胞轉(zhuǎn)染antago

9、miR-21后PDCD4及磷酸化AKT蛋白的變化情況，評價抑制miR-21對PI3K/AKT信號通路的影響。
　　2.2.Annexin V/PI雙染法檢測PI3K抑制劑（Wortmannin或 LY294002）和IM聯(lián)合作用于CML CD34+細胞和Sup-b15細胞后，CML CD34+細胞和Sup-b15細胞的細胞凋亡。
　　2.3.流式細胞術(shù)檢測PI3K抑制劑（Wortmannin或 LY294002）和IM聯(lián)合作

10、用于CML CD34+干/祖細胞和Sup-b15細胞后細胞內(nèi)磷酸化AKT蛋白的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.探討miR-21在調(diào)控CML CD34+干/祖細胞對IM凋亡抗性中的作用
　　1.1.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，免疫磁珠分選系統(tǒng)純化的CD34+干/祖細胞的純度為89.23％。
　　1.2.細胞凋亡結(jié)果顯示CML CD34+干/祖細胞對IM不敏感；經(jīng)過IM處理后miR-21表達水平有一定的上調(diào)；轉(zhuǎn)染anta

11、gomiR-21能顯著增加 IM誘導(dǎo)的CML CD34+干/祖細胞凋亡，細胞凋亡率由對照組的3.983±0.2973增加至9.437±0.5601。
　　1.3.Sup-15細胞對IM誘導(dǎo)的細胞凋亡不敏感；在IM處理后miR-21表達也發(fā)生一定的上調(diào)；轉(zhuǎn)染antagomiR-21明顯地增強IM誘導(dǎo)Sup-b15細胞凋亡。
　　1.4.IM對K562和Ku812細胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用隨著IM濃度的升高以及處理時間的延長顯

12、著升高；在IM處理后K562和Ku812細胞的miR-21表達均下調(diào)；轉(zhuǎn)染agomiR-21能抑制IM誘導(dǎo)K562和Ku812細胞凋亡。
　　2.探討miR-21調(diào)控CML CD34+干/祖細胞對IM凋亡抗性的分子機制研究
　　2.1.IM處理后CML CD34+干/祖細胞和Sup-b15細胞的PDCD4表達水平下調(diào)，K562和Ku812的PDCD4表達水平上調(diào)；而CML CD34+干/祖細胞和三種Ph+白血病細胞（K562

13、、Ku812、Sup-b15）的PTEN表達水平均下調(diào)；轉(zhuǎn)染 antagomiR-21后CML CD34+干/祖細胞PDCD4、PTEN和p-AKT的表達水平均下調(diào)。
　　2.2.使用PI3K抑制（Wortmannin和LY294002）阻斷PI3K/AKT信號通路后，IM誘導(dǎo)的CML CD34+干/祖細胞和Sup-b15的細胞凋亡顯著增加。
　　2.3.使用PI3K抑制劑（Wortmannin和 LY294002）阻斷PI