mir-29b在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖及凋亡中的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分miR-29b在慢性粒細(xì)胞白血病中的表達及臨床意義
　　慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)是一類起源于造血干細(xì)胞的疾病，該病的特征是9號染色體和22號染色體易位形成的bcr/abl融合基因，該基因編碼的融合蛋白具有持續(xù)激活的酪氨酸激酶活性。Imatinib作為第一代BCR/ABL酪氨酸激酶抑制劑在CML的治療中已經(jīng)取得了很大的成功，該小分子抑制劑治療效果好，毒性相對較低。但

2、是，臨床上對該藥物的耐藥越來越明顯。因此，探索CML治療的其他策略是如今迫切需要解決的一個問題。miRNA是一類發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達的小分子RNA，目前已經(jīng)在多種腫瘤中檢測到miRNA的異常表達。差異表達的miRNA分子能通過靶向不同的基因發(fā)揮類似于癌基因或者抑癌基因的功能。已有研究顯示miR-29b在CML急變期表達降低。為了研究miR-29b在CML中的作用，我們收集了CML病人和正常人的骨髓標(biāo)本，采用實時定量PCR的方法檢測了m

3、iR-29b的差異表達。實驗結(jié)果顯示，與正常人相比，miR-29b在CML中表達顯著降低。該結(jié)果提示低表達的miR-29b可能在CML的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。
　　第二部分miR-29b對白血病K5562細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)
　　在第一部分中，我們已經(jīng)證明miR-29b在CML中表達降低。為了進一步探討miR-29b對CML細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響，我們采用慢性粒細(xì)胞白血病急變細(xì)胞株K562細(xì)胞為研究對象，轉(zhuǎn)染miR-29b模擬

4、物上調(diào)K562細(xì)胞中miR-29b表達，分析了miR-29b對該細(xì)胞增殖、克隆形成能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。MTT的結(jié)果顯示經(jīng)miR-29b處理后的K562細(xì)胞增殖減慢;克隆形成實驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC或者未轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞相比，miR-29b顯著降低了K562細(xì)胞的克隆形成能力;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示miR-29b使K562細(xì)胞周期阻滯于G1期，定量PCR和Western blot的結(jié)果進一步證實miR-29b主要是通

5、過上調(diào)p21和p27基因和蛋白水平而使細(xì)胞周期受阻;瑞氏染色可見miR-29b處理后的K562細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡樣改變，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡顯示早期和晚期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多，Western blot結(jié)果顯示miR-29b主要是通過活化caspase3及其底物來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且也檢測到促凋亡蛋白BAX的上調(diào)和抗凋亡蛋白BCL-2的下調(diào)。這些結(jié)果提示，miR-29b能負(fù)向調(diào)控K562細(xì)胞的增殖并促進其凋亡。
　　第三部分miR-2

6、9b調(diào)控慢粒細(xì)胞增殖及凋亡的機制研究
　　我們在第二部分中已經(jīng)證明miR-29b能參與調(diào)控K562細(xì)胞增殖和凋亡。為了進一步探討miR-29b在其中發(fā)揮作用的具體機制，我們構(gòu)建了攜帶ABL3'UTR的熒光素酶載體，通過雙熒光素酶報告基因試驗分析了miR-29b是否能直接和ABL的3'UTR結(jié)合。結(jié)果顯示miR-29b與pMIR-ABL-UTR共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞能顯著降低相對熒光素酶活性，而與突變載體pMIR-ABL-UTRm共

7、轉(zhuǎn)染時未見熒光素酶活性降低。PCR及Western blot分析miR-29b轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后BCR/ABL基因和蛋白水平的改變，結(jié)果顯示miR-29b能同時降低BCR/ABL基因和蛋白表達水平。我們采用小干擾RNA干擾了ABL的表達(siABL)后分析了siABL對K562細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，結(jié)果顯示siABL與miR-29b一樣，均能抑制K562細(xì)胞增殖及其克隆形成能力，通過誘導(dǎo)p21和p27的mRNA和蛋白表達阻滯細(xì)胞周期與G