中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶對(duì)白血病細(xì)胞作用及其相應(yīng)機(jī)制的研究.pdf

1、本文對(duì)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶對(duì)白血病細(xì)胞作用及其相應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：重組慢病毒LV5-NE的構(gòu)建及其在NB4細(xì)胞中的篩選。
　　目的：構(gòu)建表達(dá)NE的慢病毒載體，在急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞中過表達(dá)NE,并篩選純的表達(dá)NE的NB4細(xì)胞株。
　　方法：以質(zhì)粒pCMV-myc-NE為模板得到PCR產(chǎn)物NE的CDS區(qū)，將NE基因連接到穿梭載體pGLV10/U6/GFP/Puro后酶切

2、驗(yàn)證，將序列正確的含NE質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）同時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。測(cè)定病毒滴度。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、NB4/LV5-NC組和NB4/LV5-NE組，熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率。慢病毒感染NB4細(xì)胞72小時(shí)后加入終濃度1μ g/mL的嘌呤霉素（puromycin，PM）進(jìn)行篩選；3天后減少PM的濃度至0.5μ g/mL，并維持此濃度繼續(xù)培養(yǎng)1周。RT-PCR和qRT-PCR鑒定NB4細(xì)胞中NE的表

3、達(dá)；western-blot進(jìn)一步鑒定NE是否表達(dá)。
　　結(jié)果：酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒LV5-NE，同源重組成功，得到重組子LV5-NE；熒光顯微鏡顯示病毒包裝成功；經(jīng)過五輪擴(kuò)增后，病毒滴度達(dá)到3.0×108。慢病毒感染NB4細(xì)胞后，用PM進(jìn)行篩選得到純的NB4/LV5-NC和NB4/LV5-NE細(xì)胞；RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)到NE在NB4細(xì)胞中表達(dá)（P<0.05）；western-blot檢測(cè)到NE蛋

4、白在NB4細(xì)胞中表達(dá)（P<0.05）。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了攜NE的慢病毒載體LV5-NE，并成功感染NB4細(xì)胞，篩選得到NB4/LV5-NC和NB4/LV5-NE細(xì)胞。
　　第二部分：LV5-NE對(duì)NB4細(xì)胞增殖、凋亡和PI3K/Akt的影響。
　　目的：探討NE對(duì)人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4生物學(xué)效應(yīng)和PI3K/Akt的影響，尋找NE致白血病的可能機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、LV5-NC組和L

5、V5-NE組。慢病毒感染NB4細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)基因NE的表達(dá)；Western blot檢測(cè)蛋白NE的表達(dá)；CCK-8法觀察NB4細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞儀測(cè)定NB4細(xì)胞周期和凋亡；qRT-PCR檢測(cè)CCD1、FOX1、mTOR、RICTOR和PTEN基因表達(dá)；Western blot檢測(cè)pAkt、Akt、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：在NB4細(xì)胞中過表達(dá)NE后與空白對(duì)照組和LV5-NC組相比：CCK-8提示NE明

6、顯促進(jìn)NB4細(xì)胞的增殖作用（P<0.05）；流式細(xì)胞術(shù)顯示NB4細(xì)胞周期阻滯在S期和G2期（P<0.05），NB4細(xì)胞凋亡減少（P<0.05）；qRT-PCR顯示基因 CCD1和 FOX1表達(dá)上調(diào),基因 mTOR、RICTOR和PTEN下調(diào)（P<0.05）；Western blot顯示pAkt和Bcl-2表達(dá)增多（P<0.05）。
　　結(jié)論：NE在NB4細(xì)胞株中過表達(dá)后可促進(jìn)NB4細(xì)胞的增殖抑制其凋亡，這一效應(yīng)可能與PI3K/Ak

7、t通路中的基因和蛋白改變有關(guān)。
　　第三部分：NE對(duì)U937細(xì)胞中PI3K/Akt的影響。
　　目的：探討在U937細(xì)胞中干擾NE后對(duì)細(xì)胞PI3K/Akt通路的影響。
　　方法：siRNA-NE在脂質(zhì)體2000的輔助下轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率；qRT-PCR檢測(cè)基因NE表達(dá)是否下調(diào)；western-blot檢測(cè)蛋白NE表達(dá)是否下調(diào)；qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞CCD1、FOX1、mTOR、RICTOR和PTE

8、N基因表達(dá)； western-blot檢測(cè)pAkt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：熒光顯微鏡觀察到 siRNA-NE的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到95％以上；qRT-PCR結(jié)果顯示基因NE表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；western-blot結(jié)果表明NE表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）；qRT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞基因CCD1和FOX1表達(dá)下調(diào),基因mTOR、RICTOR和PTEN上調(diào)（P<0.05）；western-blot結(jié)果顯示磷酸化蛋