GINS2在早幼粒細(xì)胞白血病發(fā)生中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分干擾GINS2表達(dá)對(duì)HL60細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 目的:探討干擾GINS2基因表達(dá)后對(duì)人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60增殖和凋亡的影響及其機(jī)制。
　　 方法:RT-PCR分別檢測(cè)GINS2基因在3株白血病細(xì)胞株HL60、U937、THP-1中的表達(dá)量。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)GINS2基因的靶向干擾序列，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達(dá)該基因的HL60細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況;RT-PCR和Western blot分

2、別檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后GINS2的mRNA及蛋白水平; MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖和凋亡情況;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的凋亡率;Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:在3株白血病細(xì)胞株中，GINS2的表達(dá)量由低到高依次是:THP-1，U937，HL60。干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組及未處理組相比，干擾組GINS2的mRNA及蛋白水平均顯著降低，且細(xì)胞的增殖能力明顯受抑。同時(shí)，凋亡相關(guān)蛋白 Bax表達(dá)水平顯

3、著增高而Bcl2顯著降低。
　　 結(jié)論:下調(diào)GINS2基因表達(dá)后，可通過上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl2表達(dá)來(lái)抑制HL60細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。
　　 第二部分干擾GINS2表達(dá)對(duì)HL60細(xì)胞周期調(diào)控因子的變化及機(jī)制
　　 目的:觀察下調(diào)GINS2基因的表達(dá)后對(duì)人白血病細(xì)胞株HL60周期調(diào)控因子的變化并探討其機(jī)制。
　　 方法:脂質(zhì)體介導(dǎo)并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的細(xì)胞為干擾組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞為陰性對(duì)照組，只

4、加入脂質(zhì)體的細(xì)胞為空白對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染的HL60細(xì)胞為未處理組。采用集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的增殖水平;流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞周期;Western blot檢測(cè)CDK1、CyclinB1等周期調(diào)控蛋白的變化;同時(shí)采用RT-PCR檢測(cè)ATM，CHK2，P53等周期調(diào)控因子mRNA水平的表達(dá);Western blot檢測(cè)其蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:和其他3組相比，干擾組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯增加且DNA合成受阻，增殖減慢。與G2

5、/M期相關(guān)周期調(diào)控蛋白CDK1，cyclinB1的表達(dá)隨時(shí)間變化而明顯降低。RT-PCR和western blot均顯示和其他三組相比，干擾組細(xì)胞ATM，CHK2，P53轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平顯著上調(diào)。
　　 結(jié)論:下調(diào)GINS2表達(dá)后可抑制HL60細(xì)胞DNA復(fù)制并影響其G2/M期進(jìn)程，機(jī)制可能與ATM，CHK2，P53等基因有關(guān)。
　　 第三部分?jǐn)y人GINS2基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)HL60細(xì)增殖和凋亡的影響

6、　　 目的:使用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建攜帶GINS2基因的重組腺病毒載體并進(jìn)行鑒定，觀察上調(diào)GINS2表達(dá)對(duì)HL60細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　 方法:以pcDNA3.1-GINS2質(zhì)粒作為模版，RT-PCR法擴(kuò)增GINS2基因編碼序列全長(zhǎng)并克隆入穿梭載體pAdTrace-TO4，經(jīng)轉(zhuǎn)化、酶切和測(cè)序正確后，將產(chǎn)生的重組質(zhì)粒pAdT-GINS2轉(zhuǎn)化入pAdEasy-1-B J5183感受態(tài)進(jìn)行同源重組，得到重組子pAdE-GINS

7、2。后將其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝，行PCR和熒光顯微鏡鑒定重組腺病毒Ad-GINS2。待擴(kuò)增測(cè)定滴度后感染人HL60細(xì)胞，MTT法檢測(cè)重組腺病毒感染后HL60細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)，PCR和western blot法分別檢測(cè)凋亡蛋白Bax，Bcl2的變化情況。
　　 結(jié)果:酶切、PCR、測(cè)序結(jié)果顯示GINS2基因克隆入穿梭質(zhì)粒，并得到重組腺病毒Ad-GINS2; PCR法

8、和熒光顯微鏡顯示包裝成功;經(jīng)三輪高效擴(kuò)增病毒后病毒滴度達(dá)1.35×1012 IU/ml，感染HL60細(xì)胞后，western blot可檢測(cè)到GINS2的表達(dá)，MTT和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明GINS2過表達(dá)后能促進(jìn)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)顯示病毒感染細(xì)胞后凋亡率明顯降低，Western blot顯示凋亡蛋白Bax顯著降低而Bcl2顯著升高。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建包含GINS2基因的重組腺病毒載體，可通過上調(diào)Bcl2表達(dá)而抑制Bax表達(dá)