SHIP基因在慢性粒細胞白血病發(fā)病中的作用及機制探討.pdf

1、背景：慢性粒細胞白血病（chronic myelogenous leukemia）是一種獲得性多功能造血干細胞突變后克隆性惡性增生性疾病。CML的全球年發(fā)病率約為1/10萬人口，占全部成人白血病的15％-20％。我國CML的年發(fā)病率為0.36/10萬人口，僅次于急性髓系白血病和急性淋巴細胞白血病位居第3位。
　　 近年來，隨著分子生物學及臨床醫(yī)學研究的不斷進步，CML的病因?qū)W有了很大進展，尤其是Ph染色體，bcr/abl融合基因

2、的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)研究，為慢性粒細胞性白血病病因診斷及治療作出了很大貢獻。Bcr/abl是一種抑制凋亡的基因，能通過抑制細胞凋亡，而使細胞數(shù)量增加，基因組的內(nèi)在不穩(wěn)定性增加，使細胞容易發(fā)生第二次突變，bcr/abl造成粒細胞惡性增殖的確切機制至今未完全明了。SHIP基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一種bcr/abl下游底物，該基因僅在造血細胞表達，是PI3K/Akt信號通路的負調(diào)控因子。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)急性白血病患者存在SHIP基因突變，但SHIP基因

3、在CML發(fā)病中的作用，尤其是有關(guān)臨床方面的研究國內(nèi)外尚無報道。本研究擬檢測SHIP基因在慢性粒細胞性白血病患者的表達，探討SHIP基因在bcr/abl惡性轉(zhuǎn)化中的作用。共分四部分：1、FQ-PCR檢測不同時期慢性粒細胞白血病患者SHIP基因表達變化；2、應(yīng)用干擾RNA技術(shù)封閉人白血病細胞系K562中bcr/abl基因后觀察SHIP基因的表達變化；3、應(yīng)用SHIP基因敲除小鼠檢測SHIP基因缺失對小鼠造血功能的影響；4、通過對PI3K/A

4、kt途徑中Akt磷酸化水平的變化來了解SHIP在影響細胞凋亡中的機制。
　　 方法:
　　 1.實時熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測CML患者SHIP基因表達情況；
　　 2.合成bcr/abl基因的特異性siRNA，并轉(zhuǎn)染K562細胞；
　　 3.構(gòu)建SHIP-/-轉(zhuǎn)基因骨髓受體小鼠，比較野生型和敲除SHIP基因骨髓小鼠的外周血常規(guī)、脾臟細胞學、克隆形成及骨髓細胞遷移能力改變；AnnexV/PI染色比

5、較野生型（SHIP+/+）和SHIP-/-小鼠骨髓細胞的凋亡情況；
　　 4.Western blot檢測敲除SHIP基因小鼠骨髓細胞Akt磷酸化水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.SHIP基因在CML患者表達減低:FQ-PCR結(jié)果顯示與正常人相比，CML患者SHIP mRNA表達明顯減低。
　　 2.bcr/abl融合基因抑制SHIP基因及蛋白表達
　　 2.1封閉bcr/abl融合基因后K562細

6、胞SHIP mRNA表達增加：應(yīng)用干擾RNA技術(shù)封閉K562細胞中bcr/abl融合基因的表達后，基因表達水平較空白對照組及非特異性干擾組減低，SHIP基因mRNA的表達水平增加。分別為：bcr/abl基因：特異性siRNA干擾組（5.63±0.97）×105；空白對照組：（27.14±3.05）×105；非特異siRNA轉(zhuǎn)染組：（22.42±2.15）×105]；空白對照組與非特異性轉(zhuǎn)染組間無統(tǒng)計學意義；SHIP基因：特異性siRNA

7、封閉組（3.58±0.37）×105]，空白對照組[（1.52±0.37）×105]，非特異性siRNA組[（1.53±0.20）×105拷貝]，空白對照組非特異性siRNA干擾組表達無統(tǒng)計學意義。
　　 2.2封閉融合基因后K562細胞中SHIP蛋白表達增高：轉(zhuǎn)染特異性siRNA后K562細胞中融合蛋白p210表達明顯降低，轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組p210表達無顯著變化。SHIP蛋白p145在空白對照及非特異性siRNA組中幾

8、乎無表達，特異性siRNA封閉p210后SHIP蛋白表達顯著增加。
　　 3.敲除SHIP基因骨髓受體小鼠出現(xiàn)了類似白血病的臟器侵潤及相關(guān)血液學變化
　　 3.1 SHIP-/-小鼠出現(xiàn)類似白血病臟器浸潤的表現(xiàn)：移植后3個月后，SHIP基因敲除骨髓受體小鼠部分出現(xiàn)了下肢癱瘓的特殊表現(xiàn)，表現(xiàn)為軟癱，不能支撐體重，對疼痛的反應(yīng)與對照組小鼠無明顯差別，提示僅為運動功能受損，此現(xiàn)象與臨床白血病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤的表現(xiàn)極為相似。

9、另外解剖小鼠發(fā)現(xiàn)，基因敲除骨髓受體小鼠肺臟和脾臟體積均較野生型增大。
　　 3.2敲除SHiP基因小鼠外周血中性粒細胞比例明顯增加：SHIP基因敲除小鼠的外周血中性粒細胞比例明顯增加，但早期細胞比例并不高。外周血中未發(fā)現(xiàn)有原、早幼粒細胞。血常規(guī)檢測發(fā)現(xiàn)兩種小鼠外周血中性粒細胞和淋巴細胞比例有所不同而白細胞總數(shù)無顯著差異。
　　 3.3組織學表現(xiàn)為肺臟、脾臟中中性粒細胞及單核細胞高度浸潤：與野生型小鼠相比，SHIP-/-小

10、鼠肺臟部分區(qū)域明顯實變，顯微鏡下觀察實變區(qū)有髓系細胞浸潤，浸潤的細胞主要集中在肺泡區(qū)，部分區(qū)域還有氣管腔內(nèi)中性粒細胞的浸潤。脾臟結(jié)構(gòu)明顯受損，正常淋巴細胞生發(fā)中心消失紅髓白髓界限消失。為大量髓系細胞侵潤。
　　 3.4細胞學檢測發(fā)現(xiàn)SHIP基因缺失骨髓受體小鼠脾臟中性粒細胞比例明顯增加；外周血中性粒細胞比例亦增高：與正常小鼠脾臟細胞相比，SHIP基因缺失骨髓受體小鼠的脾臟和外周血中性粒細胞比例明顯增加，但外周血中未發(fā)現(xiàn)幼稚細胞。

11、
　　 3.5免疫學檢測發(fā)現(xiàn)SHIP基因缺失骨髓受體小鼠骨髓、外周血及脾臟的髓系細胞尤其是中性粒細胞比例均顯著增加：用髓系細胞表面標志Gr-1和Mac-1進行免疫學標定，進一步證實了上述組織器官中髓系細胞的含量變化，其結(jié)果顯示SHIP基因缺失小鼠骨髓髓系細胞（Gr1+Mac1+）（40.38±0.87）％比wild-type（WT）小鼠（20.91±1.11）％增加近1倍。脾臟的髓系細胞（14.47±0.67）％增加更明顯，為W

12、T（3.49±0.47）％的4倍左右。外周血髓系細胞比例（60.71±1.72）％也比WT小鼠（23.38±0.62）％明顯增多。
　　 3.6克隆培養(yǎng)證實敲除SHIP基因?qū)е滦∈蠊撬杷柘导毎鲋吃黾樱呵贸齋HIP基因小鼠骨髓單位細胞數(shù)形成克隆數(shù)量明顯多于野生型小鼠，提示該組細胞中的干祖細胞比例高于野生型小鼠。比較兩種小鼠克隆形成比例，混合克隆與粒單克隆（CFU-MIX、 CFU-GM）的比例在基因敲除小鼠多于野生型小鼠，形成的

13、克隆也比野生型大，提示敲除SHIP基因?qū)е滦∈蠊撬杓毎鲋衬芰υ鰪姟?br>　　 3.7 Transwell實驗證實敲除SHIP基因使小鼠骨髓細胞運動能力增強：敲除SHIP基因的小鼠骨髓低密度細胞跨膜運動能力明顯增強，3組敲除SHIP基因細胞平均跨膜細胞數(shù)（0.35×105/2×105）明顯多于野生型小鼠（0.07×105/2×105）。
　　 3.8敲除SHIP基因?qū)е滦∈蠊撬杓毎麑o血清饑餓誘導(dǎo)凋亡耐受力增強：36小時無血

14、清培養(yǎng)后，流式細胞學檢測凋亡率發(fā)現(xiàn)，SHIP-/-的小鼠骨髓單個核細胞凋亡率（3.86±0.28）明顯低于對照組細胞（19.6±1.28）。提示SHIP基因缺失導(dǎo)致小鼠細胞抗凋亡能力增強。
　　 4.SHIP基因缺失細胞內(nèi)Akt磷酸化水平升高：Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，在SHIP基因缺失的小鼠骨髓細胞中，其Akt的磷酸化水平明顯增加，其在未受任何刺激情況下就有明顯的p-Akt出現(xiàn)，在受到GM-CSF刺激的情況下表現(xiàn)更為明

15、顯，提示SHIP能夠抑制Akt的磷酸化。
　　 結(jié)論:
　　 1.SHIP基因在CML患者中表達減低甚至表達缺失。
　　 2.Bcr/abl融合基因抑制SHIP基因表達。
　　 3.敲除SHIP基因可促進造血細胞中髓系細胞增殖，抑制細胞凋亡，增強細胞的運動侵襲能力。敲除SHIP基因可使細胞內(nèi)磷酸化Akt水平增加，并對GM-CSF的反應(yīng)增強。
　　 4.SHIP基因通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑發(fā)揮其