雷公藤甲素通過miR-21調(diào)節(jié)白血病細胞藥物敏感性的分子機制.pdf

1、耐藥是臨床治愈白血病的一個主要障礙。腫瘤耐藥是一種多因子共同作用導致的現(xiàn)象，盡管發(fā)現(xiàn)藥物滅活，藥物外排，存活通路激活，凋亡機制缺陷等與耐藥有關(guān)，但是耐藥的決定性因素尚不清楚。近來，大量的研究發(fā)現(xiàn)microRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。其中，部分microRNA通過影響特定的信號通路影響腫瘤對化療藥物的敏感性。因此，microRNA在耐藥形成中的作用日益受到學者們的關(guān)注。
　　 MiR-21是第一個在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的mi

2、croRNA，并且是唯一在所有惡性腫瘤均高表達的microRNA。MiR-21被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的診斷標志和預(yù)后標志顯著相關(guān)，因此其可能成為惡性腫瘤診斷和預(yù)后判斷的生物學標記。此外，異常表達的miR-21可以預(yù)測腫瘤對傳統(tǒng)化療藥物，如吉西他濱，多西他賽，替莫唑胺，5-氟尿嘧啶等的反應(yīng)。最近，幾項研究探討了miR-21在髓細胞白血病和淋巴細胞白血病耐藥中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21反義寡核苷酸提高三氧化二砷對急性髓細胞白血病細胞的毒性。抑制m

3、iR-21，增強三氧化二砷和阿糖胞苷誘導的慢性髓細胞白血病細胞的凋亡。MiR-21的這些作用，部分是通過影響PDCD4表達行成的。
　　 雷公藤甲素是1972年首次從雷公藤根部提取的二萜類化合物，現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了人工合成的工藝。文獻報道，雷公藤甲素具有抗炎，免疫抑制，抗生育和抗腫瘤作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素在體外能夠抑制多種腫瘤的增殖，誘導腫瘤的凋亡；在體內(nèi)，雷公藤甲素可以抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。研究證實，雷公藤甲素可以抑制細胞周

4、期和細胞存活相關(guān)蛋白，包括cyclins D1，B1，and A1，Cdc-25；Bcl-X和c-Jun。雷公藤甲素還降低抗凋亡蛋白如XIAP，Bcl-2和Mcl-1等的表達。在白血病和卵巢癌細胞中，雷公藤甲素誘導caspase依賴的凋亡；在胰腺癌中，雷公藤甲素誘導caspase非依賴的自噬性死亡。
　　 目的：本研究的目的是觀察雷公藤甲素是否通過miR-21影響白血病細胞對化療藥物阿霉素的敏感性，并且探討其可能的分子機制。

5、r>　　 方法：
　　 1.雷公藤甲素的毒性和耐藥逆轉(zhuǎn)作用采用MTT實驗。
　　 2.miR-21的表達采用SYBR green PCR方法。
　　 3.NF-кB的活性采用EMSA方法檢測。NF-кB與miR-21基因啟動子區(qū)域結(jié)合采用ChIP方法。
　　 4.miR-21模擬物和抑制物由化學合成，并且轉(zhuǎn)染入K562細胞或K562/A02細胞。
　　 5.P65，T-AKT，P-AKT，PTE

6、N，BCL-2蛋白水平采用western blot檢測。
　　 6.細胞凋亡率采用流式細胞儀檢測Annexin V/PI染色細胞。
　　 7.流式細胞儀檢測P糖蛋白表達。P糖蛋白功能檢測采用羅丹明-123蓄積實驗。
　　 8.本研究假設(shè)，在K562細胞中，PTEN是miR-21的一個直接靶基因。為驗證此假說，K562細胞共轉(zhuǎn)染PTEN-3'非編碼序列熒光素酶報告基因和miR-21。
　　 9.為了探討PT

7、EN與阿霉素毒性的關(guān)系，PTEN siRNA被轉(zhuǎn)染入K562細胞，接著采用一系列濃度的阿霉素作用。
　　 10.P65，PTEN mRNA水平采用SYBR green PCR.方法檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1.因為耐藥逆轉(zhuǎn)劑需要采用對受試細胞無抑制或無毒性的濃度，雷公藤毒性試驗結(jié)果提示，5 nmol/L雷公藤甲素被用于后續(xù)耐藥逆轉(zhuǎn)試驗。
　　 2.雷公藤甲素降低miR-21在K562/A02細胞的表達水

8、平。P65 mRNA水平和蛋白水平，以及P65轉(zhuǎn)錄活性，在雷公藤甲素作用后明顯下降。
　　 3.ChIP試驗和EMSA試驗均證明NF-кB能夠與miR-21啟動子區(qū)域結(jié)合。ChIP試驗進一步證明，K562/A02細胞經(jīng)雷公藤甲素作用后，NF-кB與miR-21啟動子結(jié)合明顯下降。
　　 4.5 nmol/L雷公藤甲素提高K562/A02細胞對阿霉素的敏感性。3μg/mL阿霉素誘導的K562/A02細胞凋亡率為4.3％，當

9、與5 nmol/L雷公藤甲素聯(lián)合應(yīng)用時，凋亡率上升到18.5％。
　　 5.雷公藤甲素明顯抑制P糖蛋白在K562/A02細胞的表達。羅丹明-123蓄積試驗表明，雷公藤甲素能夠抑制P糖蛋白功能。
　　 6.K562細胞轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后，miR-21水平明顯上升；K562/A02細胞轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后，miR-21水平明顯下降。K562細胞轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后，存活率明顯升高；K562/A02細胞轉(zhuǎn)染miR

10、-21抑制物后，存活率明顯下降。
　　 7.K562細胞轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后，PTEN蛋白水平明顯下降；K562/A02細胞轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后，PTEN蛋白水平明顯上升。MiR-21降低K562細胞PTEN-3'編碼序列熒光素酶報告基因活性。
　　 8.PTEN siRNA顯著降低K562細胞PTEN蛋白水平。K562細胞轉(zhuǎn)染PTEN siRNA后，細胞存活率升高，而且P糖蛋白的表達升高。
　　 9.雷

11、公藤甲素能夠有效抑制BCL-2在K562/A02細胞的表達。K562細胞轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后，BCL-2表達水平明顯上升；K562/A02細胞轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后，BCL-2表達水平明顯下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.雷公藤甲素提高K562/A02細胞對阿霉素的敏感性。
　　 2.雷公藤甲素抑制miR-21在K562/A02細胞的表達，從而升高PTEN蛋白水平。
　　 3.雷公藤甲素通過PTEN/