調(diào)節(jié)急性髓系白血病干細(xì)胞對同種異體NK細(xì)胞殺傷的敏感性.pdf

1、成人急性髓細(xì)胞白血病(AML)是成人白血病的主要類型，占成人各種白血病的60％左右。雖然新型藥物的應(yīng)用和治療方法的改進(jìn)，使急性白血病的完全緩解率和5年生存率已有明顯的提高，但50％以上的患者仍然會復(fù)發(fā)。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，造成白血病發(fā)生、治療中耐藥和白血病復(fù)發(fā)的根本原因是白血病患者體內(nèi)存在著一群白血病干細(xì)胞(LSC)，白血病干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為提高白血病治愈率找到了明確治療的靶標(biāo)。大多數(shù)白血病干細(xì)胞處于CD34+CD38-CD123+發(fā)育階

2、段，可以根據(jù)其表面抗原進(jìn)行分離純化。 但由于臨床上從白血病患者體內(nèi)提取LSC受到許多方面的制約，影響了對LSC特性及治療的研究。腫瘤細(xì)胞株具有永生化的特性，可在體外培養(yǎng)長期生存，在動物體內(nèi)形成腫瘤，因此推測腫瘤細(xì)胞株中可能存在腫瘤干細(xì)胞。FGRucker等使用DNA微陣技術(shù)，采用比較基因組雜交的方法，分析了17個髓系白血病細(xì)胞株，顯示髓系細(xì)胞株反應(yīng)了內(nèi)在原代細(xì)胞遺傳性的異常，支持細(xì)胞株代表了可靠和準(zhǔn)確的模型系統(tǒng)。KG1A細(xì)胞株來

3、源于一男性AML患者，高表達(dá)CD34抗原，對粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子無反應(yīng)，對柔紅霉素耐藥。因此我們擬在急性髓系白血病KG1A細(xì)胞株中尋找符合LSC表型的細(xì)胞，并對其分離及進(jìn)行功能鑒定，以建立獲得數(shù)目較多的LSC的技術(shù)平臺。 研究發(fā)現(xiàn)LSC 95％處于G0期，對誘導(dǎo)凋亡的刺激不敏感，傳統(tǒng)的細(xì)胞周期化療藥對其無效，因此，單純依賴化療新藥物的開發(fā)和治療方案的改進(jìn)，欲進(jìn)一步提高CR率，延長緩解期和生存期是比較困難的。骨髓移植雖能延

4、長患者CR后的生存期，但限于供體來源和經(jīng)濟(jì)條件，大面積推廣尚有困難。消滅殘留白血病細(xì)胞的另一重要途徑是通過免疫治療。 NK細(xì)胞是淋巴細(xì)胞譜系中不同于T、B淋巴細(xì)胞的一類大顆粒淋巴細(xì)胞，其代表性表型為CD56+、CD16+。它是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，無需抗原預(yù)先致敏，與靶細(xì)胞混合后4小時內(nèi)即可發(fā)揮殺傷作用，表現(xiàn)為速發(fā)效應(yīng)，因此位于機(jī)體抵御腫瘤和病毒感染的第一道防線，同時又能通過早期分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子來調(diào)節(jié)獲得性免疫

5、，故也是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控、抗腫瘤和抗感染等方面發(fā)揮著重要的作用。體外研究顯示，同種反應(yīng)性NK細(xì)胞對多種人類腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性：包括髓系白血病細(xì)胞、除普通型ALL以外的淋巴造血系腫瘤細(xì)胞。在前臨床模型中，將人類同種反應(yīng)性NK細(xì)胞輸注到已植入人AML細(xì)胞的NOD/SCID(non-obesediabetic/severe combined immunodeficiency)小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)：未給予人

6、同種反應(yīng)性NK細(xì)胞組小鼠均于3周內(nèi)死亡；而輸入人同種反應(yīng)性細(xì)胞組(即使輸入的細(xì)胞數(shù)很少)，這些同種反應(yīng)性細(xì)胞即可清除白血病細(xì)胞并使小鼠存活120天。動物實驗及臨床移植均證實由KIR不相合產(chǎn)生的同種反應(yīng)性NK細(xì)胞是allo-HSCT預(yù)后的有利因素。Miller等對一組接受大劑量環(huán)磷酰胺和氟達(dá)拉賓治療的腫瘤患者，在骨髓抑制期輸注來自HLA單倍體相合同胞供者的NK細(xì)胞，觀察到NK細(xì)胞在這些患者體內(nèi)的擴(kuò)增，并在具有KIR-配體不合供者組觀察到血

7、液學(xué)緩解。 本研究分四個部分，第一部分研究了Allo-NK細(xì)胞對急性髓系白血病KG1A細(xì)胞的殺傷活性及可能的機(jī)制；第二部分從KG1A細(xì)胞株中找到了符合LSC表型的細(xì)胞，并對其分離及進(jìn)行功能鑒定，建立了獲得數(shù)目較多的LSC的技術(shù)平臺；第三部分探討Allo-NK細(xì)胞對LSCs細(xì)胞的殺傷活性；第四部分研究化療藥物在調(diào)節(jié)白血病干細(xì)胞對ALLO-NK殺傷敏感性中的作用。 研究目的和方法： 第一部分：ALLO-NK細(xì)胞對急性

8、髓系白血病KG1a細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 目的：觀察ALLO-NK細(xì)胞對急性髓系白血病細(xì)胞株KG1a的細(xì)胞毒效應(yīng)，探討NK殺傷KG1a細(xì)胞的初步分子機(jī)制。 方法：免疫磁珠法分選CD3-CD56+的NK細(xì)胞，采用乳酸脫氫酶殺傷實驗(LDH)及甲基纖維素克隆形成檢測NK對KG1A細(xì)胞和K562細(xì)胞的殺傷率和克隆抑制率。用流式細(xì)胞儀KG1A細(xì)胞表面NKG2D配體MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表達(dá)情況及HLA-

9、I分子表達(dá)情況；RT-PCR檢測NKG2D配體在mRNA水平的表達(dá)，SSP法檢測KG1A細(xì)胞基因型，PCR檢測5例健康者的KIR分型。 第二部分：急性白血病KG1a細(xì)胞株中白血病干細(xì)胞的分離和鑒定 目的：分離和鑒定急性髓系白血病KG1a細(xì)胞中自血病干細(xì)胞 方法：免疫磁珠法分選KG1a細(xì)胞中CD34+CD38-細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測其表面抗原、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化功能。以甲基纖維素檢測其克隆形成能力，以NOD/SCID小鼠

10、為動物模型，尾靜脈接種CD34+CD38-細(xì)胞建立動物模型，以細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面抗原、病理切片等方法鑒定模型；并連續(xù)轉(zhuǎn)種檢測其自我更新能力，證明分選出的CD34+CD38-細(xì)胞符合白血病干細(xì)胞的特性。 第三部分：ALLO-NK細(xì)胞對急性髓系白血病干細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 目的：探討同種異體NK細(xì)胞(CD3-CD16+CD56+)對急性髓系CD34+CD38-(LSC)的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，并與較之晚期階段的CD34+CD38+比較，

11、為NK細(xì)胞用于LSC的治療提供實驗依據(jù)。 方法： 免疫磁珠法分選CD34+CD38-細(xì)胞，乳酸脫氫酶殺傷實驗(LDH)及甲基纖維素克隆形成檢測NK對CD34+CD38-細(xì)胞的殺傷率和克隆抑制率。 第四部分：調(diào)節(jié)LSCs對ALLO-NK細(xì)胞殺傷的敏感性 目的：觀察不同藥物對作用LSCs細(xì)胞后其對NK細(xì)胞殺傷敏感性的影響，及克隆抑制率。 方法：選用LSCs細(xì)胞為研究對象，不同藥物(AS2O3、DNR、

12、MITO)與LSCs細(xì)胞37℃共孵育24小時，乳酸脫氫酶殺傷實驗(LDH)及甲基纖維素克隆形成實驗檢測NK對藥物作用后LSCs細(xì)胞的殺傷率及克隆抑制率，流式細(xì)胞儀分析NKG2D配體的變化。 結(jié)論： 1.Allo-NK對KG1a白血病群體細(xì)胞具有一定的殺傷活性，殺傷機(jī)制與供者NK細(xì)胞的KIR與KG1A的HLA-I分子基因型錯配有關(guān)。 2.KG1A細(xì)胞株中存在白血病干細(xì)胞，免疫磁珠法從KG1a細(xì)胞中分離白血病干細(xì)胞的

13、方法可靠。 3.分選出的LSCs大部分處于G0期，在體外可分化為LSCs和非LSCs，具有分化功能。 4.分選出的細(xì)胞在體外可形成克隆，在NOD/SCID小鼠體內(nèi)可連續(xù)轉(zhuǎn)種形成白血病模型，具有自我更新功能。 5.體外實驗表明ALLO-NK細(xì)胞對白血病干細(xì)胞的殺傷率低，對非白血病干細(xì)胞殺傷率高，白血病干細(xì)胞抵抗NK細(xì)胞的殺傷。 6.AS2O3可上調(diào)CD34+CD38-細(xì)胞(LSCs)表面NKG2D配體ULB